耐阿霉素白血病細(xì)胞株SHI-1-ADR的建立及其耐藥機(jī)制的初步研究.pdf

1、背景：
　　白血病是一類惡性程度較高的血液系統(tǒng)腫瘤，預(yù)后普遍較差，死亡率高，在我國各年齡組惡性腫瘤的死亡率男性中占第6位，女性中占第8位。其經(jīng)典治療方案為蒽環(huán)類藥物聯(lián)合阿糖胞苷(cytosinearabinoside，Ara-C)，多數(shù)成年AML患者通過化療可獲得完全緩解(completeremission，CR)，但只有不到三分之一的患者可獲得長期無病生存（disease-freesurvival，DFS）。治療失敗的主要原因是

2、腫瘤細(xì)胞對(duì)傳統(tǒng)化療發(fā)生了多藥耐藥（multidrugresistance；MDR），多藥耐藥已成為復(fù)發(fā)難治白血病患者治療最大的障礙。目前化療相關(guān)MDR機(jī)制尚未完全闡明，建立白血病耐藥細(xì)胞株是研究白血病耐藥的基礎(chǔ)及逆轉(zhuǎn)機(jī)制的必要條件。本文以急性髓細(xì)胞白血?。∕5）型細(xì)胞株SHI-1為研究模型,在構(gòu)建耐藥細(xì)胞株SHI-1/ADR的基礎(chǔ)上,初步研究了該細(xì)胞株的生物學(xué)特性，探索窖蛋白-1（caveolin-1,CAV-1）及自噬在白血病發(fā)生耐藥

3、過程的作用以及探索逆轉(zhuǎn)耐藥的機(jī)制。
　　研究目的：
　　1、構(gòu)建耐阿霉素細(xì)胞株SHI-1/ADR，研究其生物學(xué)特性；
　　2、探索窖蛋白-1及自噬參與白血病多藥耐藥的形成及抑制自噬聯(lián)合常規(guī)化療對(duì)耐藥株的影響。
　　方法：
　　1、通過濃度遞增法增加阿霉素濃度，逐步誘導(dǎo)SHI-1細(xì)胞對(duì)阿霉素產(chǎn)生耐藥，最終建立耐阿霉素細(xì)胞株SHI-1/ADR；
　　2、采用瑞氏染色法觀察耐藥株形態(tài)學(xué)變化，CCK-8法了解

4、細(xì)胞增殖、耐藥情況，流式細(xì)胞術(shù)觀察阿霉素耐藥對(duì)細(xì)胞周期的影響；
　　3、實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)CAV-1、Beclin-1及MDR-1在耐藥株及親本細(xì)胞中表達(dá)情況；
　　4、通過CCK-8法了解自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)單獨(dú)及聯(lián)合常規(guī)常規(guī)化療對(duì)耐藥株SHI-1/ADR增殖的影響，流式細(xì)胞術(shù)了解凋亡情況；
　　結(jié)果：
　　1、通過濃度遞增法歷時(shí)8個(gè)月成功構(gòu)建了耐阿霉素

5、細(xì)胞株SHI-1/ADR；
　　2、SHI-1/ADR細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)生了細(xì)微的改變：細(xì)胞間隙增加，胞核噬堿性加深，胞膜周邊出現(xiàn)少量小顆粒，細(xì)胞體積大小不均，可見不規(guī)則形細(xì)胞；CCK-8檢測(cè)示：SHI-1/ADR倍增時(shí)間延長4.853小時(shí)（P＜0.05）；SHI-1/ADR細(xì)胞IC50=6.911±0.255ug/ml，SHI-1細(xì)胞IC50=0.969±0.164ug/ml（P＜0.05）,RI=7.132；高三尖酯堿、長春新堿、依

6、托泊苷耐藥指數(shù)分別為12.972、69.554、2.219，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)到耐藥株S期細(xì)胞減少49.73％（P＜0.05），G0/G1期細(xì)胞增加50.69％（P＜0.05），G2/M期細(xì)胞減少32.80%（P＞0.05）；
　　3、RT-PCR檢測(cè)顯示：SHI-1/ADR細(xì)胞CAV-1基因表達(dá)增加3.042倍（P＜0.05），MDR-1基因表達(dá)增加4.529倍（P＜0.05），Beclin-1基

7、因增加了3.839倍（P＜0.05）；
　　4、CCK-8檢測(cè)示：3-MA聯(lián)合阿霉素對(duì)SHI-1/ADR細(xì)胞24h抑制率（66.856±6.158）%（P＜0.05），36小時(shí)抑制率（73.583±7.707）%（P＜0.05），48h抑制率（83.209±7.639）%（P＜0.05）。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)示：3-MA聯(lián)合阿霉素SHI-1/ADR細(xì)24h早期凋亡率（51.800±3.671）%（P＜0.05）。
　　結(jié)論：