Icotinib耐藥NSCLC細胞株的建立及其耐藥機制研究.pdf

1、目的:
　　近年來，隨著腫瘤個體化靶向治療的迅速發(fā)展，以吉非替尼(Gefitinib)和厄洛替尼(Erlotinib)為代表的表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermalgrowth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI）在EGFR陽性突變的晚期非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者中療效顯著。但隨著用藥時間的延長

2、（12-14個月），患者最終對其產生耐藥性，病情復發(fā)或進展。研究發(fā)現(xiàn)，EGFR-TKI潛在的耐藥機制是復雜和多樣的，涉及靶蛋白的改變或EGFR的T790M繼發(fā)突變、EGFR下游通路中PI3K、KRAS、BRAF等基因突變、c-Met擴增或HGF過表達、發(fā)生上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）和向小細胞類型轉化(small cell lung cancer，SCLC)等，但是還有20-

3、30％的耐藥機制不明確，可能與表觀遺傳學、代謝異常等有關。腫瘤的發(fā)生和進展都會產生大量的代謝物變化，所以腫瘤也是一種代謝性疾病。利用代謝組學的方法尋找親本細胞和耐藥細胞之間差異的代謝物，有助于了解耐藥發(fā)生的機制，尋找新的潛在藥物靶點。
　　方法:
　　本研究中我們選用三種不同的NSCLC細胞株A549（EGFR野生型）、PC-9（EGFR敏感突變型）和H1975（EGFR T790M繼發(fā)突變型），DNA直接測序法檢測A549

4、、PC-9和H1975的EGFR突變狀態(tài);采用國產的EGFR-TKI(?？颂婺幔琲cotinib)在體外以小劑量濃度梯度遞增法誘導建立?？颂婺崮退幹闍549/IR、PC-9/IR和H1975/IR。從不同角度對耐藥株進行鑒定:3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽法(3-(4，5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3，5-di-phenytetrazoliumromide，MTT)檢測PC-9/IR的

5、耐藥性及耐藥穩(wěn)定性;光鏡下觀察其形態(tài)學變化;DNA測序法檢測EGFR的T790M狀態(tài);應用Real-time PCR和Western blot檢測EGFR及其旁路信號相關分子的表達;小鼠移植瘤模型檢測PC-9/IR耐藥細胞在體內的增殖能力。分別收集親本細胞和耐藥細胞利用核磁共振分析技術手段分析親本細胞和耐藥細胞的差異代謝物，通過主成分分析(principal component analysis，PCA)和偏最小二乘法-判別分析(par

6、tial least squares discriminant analysis，PLS-DA)分析得出載荷圖和VIP(variable importance in projection，VIP)圖，找到區(qū)分親本細胞和耐藥細胞貢獻最大的代謝物。通過對差異代謝物代謝通路的分析推測可能的藥物作用靶點，并檢測針對此靶點的抑制劑對PC-9/IR耐藥細胞生長和增殖的影響，以及與此靶點相關的蛋白質在PC-9/IR耐藥細胞中的表達情況。
　　結

7、果:
　　歷時近8個月獲得?？颂婺崮退幹闍549/IR(A549/Icotinib resistant)和H1975/IR，近6個月獲得PC-9/IR耐藥細胞。MTT法檢測到A549/IR、H1975/IR和PC-9/IR對?？颂婺崮退?，且PC-9/IR耐藥細胞的半數抑制濃度(50％ inhibitingconcentration，IC50)是21.49μmol/L，高于PC-9親本細胞的IC50值1.32μmol/L，達到高度耐

8、藥狀態(tài);A549/IR耐藥細胞的IC50為173.73μmol/L，高于A549親本細胞的IC50值17.46μmol/L; H1975/IR耐藥細胞的IC50為196.73μmol/L，高于H1975親本細胞的IC50值23.93μmol/L。
　　對PC-9/IR耐藥的穩(wěn)定性檢測發(fā)現(xiàn)在2μmol/L埃克替尼中持續(xù)培養(yǎng)PC-9/IR4個月，其耐藥性依然穩(wěn)定;PC-9/IR耐藥細胞未發(fā)生T790M繼發(fā)突變。PC-9/IR耐藥細胞中

9、EGFR、PI3K、AKT、STAT3和c-Met的表達水平較親本株高，分別為12.09、5.73、3.72、7.44和5.31倍;?？颂婺岵荒芤种芇C-9/IR耐藥細胞中AKT和STAT3的活化且多藥耐藥蛋白ABCG2(ATP-binding cassette superfamily Gmember2，ABCG2)在PC-9/IR耐藥細胞中表達量升高;結合c-Met及下游分子在PC-9/IR耐藥細胞中表達升高且利用c-Met抑制劑（克

10、唑替尼，crizotinib）可以抑制PC-9/IR耐藥細胞體外、體內的增殖，提示PC-9/IR耐藥細胞發(fā)生了c-Met旁路活化。
　　核磁共振分析技術得到A549/IR、H1975/IR、PC-9/IR和A549、PC-9、H1975的代謝指紋圖譜，分析6大類包括氨基酸及衍生物、有機酸類、糖類、醇類、核苷酸組分等共62種代謝物的濃度。運用PCA主成分分析和PLS-DA多元統(tǒng)計分析得到親本細胞和耐藥細胞代謝輪廓相異，并分別得出VI

11、P值大于1的15種區(qū)分親本細胞和耐藥細胞代謝差異的代謝物。三種不同EGFR狀態(tài)的細胞系，篩選得到的區(qū)分親本細胞和耐藥細胞的差異代謝物不完全相同:區(qū)分PC-9細胞和PC-9/IR耐藥細胞的標志差異代謝物是谷氨酸，醋酸鹽、尿酸、膽堿和丙氨酸;區(qū)分A549和A549/IR細胞的差異代謝物是谷氨酸、谷氨酰胺、乳酸、天冬氨酸和谷胱甘肽;區(qū)分H1975細胞和H1975/IR耐藥細胞的差異代謝物是乳酸、谷氨酸、?；撬?、醋酸鹽和脯氨酸。
　　PC

12、-9/IR耐藥細胞的生長對谷氨酰胺存在濃度依賴性，促進谷氨酰胺酶表達的c-Myc基因在PC-9/IR耐藥細胞中表達升高且埃克替尼不能抑制c-Myc在PC-9/IR耐藥細胞中表達。谷氨酰胺酶抑制劑Compound968可以抑制PC-9/IR耐藥細胞在體外的增殖。
　　結論:
　　成功建立了A549/IR、H1975/IR和PC-9/IR三株耐藥細胞。研究結果提示PC-9/IR的耐藥與c-Met活化、ABCG2表達升高及代謝變化