Icotinib耐藥NSCLC細(xì)胞株的建立及其耐藥機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　近年來，隨著腫瘤個(gè)體化靶向治療的迅速發(fā)展，以吉非替尼(Gefitinib)和厄洛替尼(Erlotinib)為代表的表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermalgrowth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI）在EGFR陽性突變的晚期非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者中療效顯著。但隨著用藥時(shí)間的延長

2、（12-14個(gè)月），患者最終對其產(chǎn)生耐藥性，病情復(fù)發(fā)或進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn)，EGFR-TKI潛在的耐藥機(jī)制是復(fù)雜和多樣的，涉及靶蛋白的改變或EGFR的T790M繼發(fā)突變、EGFR下游通路中PI3K、KRAS、BRAF等基因突變、c-Met擴(kuò)增或HGF過表達(dá)、發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）和向小細(xì)胞類型轉(zhuǎn)化(small cell lung cancer，SCLC)等，但是還有20-

3、30％的耐藥機(jī)制不明確，可能與表觀遺傳學(xué)、代謝異常等有關(guān)。腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展都會產(chǎn)生大量的代謝物變化，所以腫瘤也是一種代謝性疾病。利用代謝組學(xué)的方法尋找親本細(xì)胞和耐藥細(xì)胞之間差異的代謝物，有助于了解耐藥發(fā)生的機(jī)制，尋找新的潛在藥物靶點(diǎn)。
　　方法:
　　本研究中我們選用三種不同的NSCLC細(xì)胞株A549（EGFR野生型）、PC-9（EGFR敏感突變型）和H1975（EGFR T790M繼發(fā)突變型），DNA直接測序法檢測A549

4、、PC-9和H1975的EGFR突變狀態(tài);采用國產(chǎn)的EGFR-TKI(?？颂婺幔琲cotinib)在體外以小劑量濃度梯度遞增法誘導(dǎo)建立?？颂婺崮退幹闍549/IR、PC-9/IR和H1975/IR。從不同角度對耐藥株進(jìn)行鑒定:3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽法(3-(4，5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3，5-di-phenytetrazoliumromide，MTT)檢測PC-9/IR的

5、耐藥性及耐藥穩(wěn)定性;光鏡下觀察其形態(tài)學(xué)變化;DNA測序法檢測EGFR的T790M狀態(tài);應(yīng)用Real-time PCR和Western blot檢測EGFR及其旁路信號相關(guān)分子的表達(dá);小鼠移植瘤模型檢測PC-9/IR耐藥細(xì)胞在體內(nèi)的增殖能力。分別收集親本細(xì)胞和耐藥細(xì)胞利用核磁共振分析技術(shù)手段分析親本細(xì)胞和耐藥細(xì)胞的差異代謝物，通過主成分分析(principal component analysis，PCA)和偏最小二乘法-判別分析(par

6、tial least squares discriminant analysis，PLS-DA)分析得出載荷圖和VIP(variable importance in projection，VIP)圖，找到區(qū)分親本細(xì)胞和耐藥細(xì)胞貢獻(xiàn)最大的代謝物。通過對差異代謝物代謝通路的分析推測可能的藥物作用靶點(diǎn)，并檢測針對此靶點(diǎn)的抑制劑對PC-9/IR耐藥細(xì)胞生長和增殖的影響，以及與此靶點(diǎn)相關(guān)的蛋白質(zhì)在PC-9/IR耐藥細(xì)胞中的表達(dá)情況。
　　結(jié)

7、果:
　　歷時(shí)近8個(gè)月獲得埃克替尼耐藥株A549/IR(A549/Icotinib resistant)和H1975/IR，近6個(gè)月獲得PC-9/IR耐藥細(xì)胞。MTT法檢測到A549/IR、H1975/IR和PC-9/IR對?？颂婺崮退帲襊C-9/IR耐藥細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(50％ inhibitingconcentration，IC50)是21.49μmol/L，高于PC-9親本細(xì)胞的IC50值1.32μmol/L，達(dá)到高度耐

8、藥狀態(tài);A549/IR耐藥細(xì)胞的IC50為173.73μmol/L，高于A549親本細(xì)胞的IC50值17.46μmol/L; H1975/IR耐藥細(xì)胞的IC50為196.73μmol/L，高于H1975親本細(xì)胞的IC50值23.93μmol/L。
　　對PC-9/IR耐藥的穩(wěn)定性檢測發(fā)現(xiàn)在2μmol/L?？颂婺嶂谐掷m(xù)培養(yǎng)PC-9/IR4個(gè)月，其耐藥性依然穩(wěn)定;PC-9/IR耐藥細(xì)胞未發(fā)生T790M繼發(fā)突變。PC-9/IR耐藥細(xì)胞中

9、EGFR、PI3K、AKT、STAT3和c-Met的表達(dá)水平較親本株高，分別為12.09、5.73、3.72、7.44和5.31倍;?？颂婺岵荒芤种芇C-9/IR耐藥細(xì)胞中AKT和STAT3的活化且多藥耐藥蛋白ABCG2(ATP-binding cassette superfamily Gmember2，ABCG2)在PC-9/IR耐藥細(xì)胞中表達(dá)量升高;結(jié)合c-Met及下游分子在PC-9/IR耐藥細(xì)胞中表達(dá)升高且利用c-Met抑制劑（克

10、唑替尼，crizotinib）可以抑制PC-9/IR耐藥細(xì)胞體外、體內(nèi)的增殖，提示PC-9/IR耐藥細(xì)胞發(fā)生了c-Met旁路活化。
　　核磁共振分析技術(shù)得到A549/IR、H1975/IR、PC-9/IR和A549、PC-9、H1975的代謝指紋圖譜，分析6大類包括氨基酸及衍生物、有機(jī)酸類、糖類、醇類、核苷酸組分等共62種代謝物的濃度。運(yùn)用PCA主成分分析和PLS-DA多元統(tǒng)計(jì)分析得到親本細(xì)胞和耐藥細(xì)胞代謝輪廓相異，并分別得出VI

11、P值大于1的15種區(qū)分親本細(xì)胞和耐藥細(xì)胞代謝差異的代謝物。三種不同EGFR狀態(tài)的細(xì)胞系，篩選得到的區(qū)分親本細(xì)胞和耐藥細(xì)胞的差異代謝物不完全相同:區(qū)分PC-9細(xì)胞和PC-9/IR耐藥細(xì)胞的標(biāo)志差異代謝物是谷氨酸，醋酸鹽、尿酸、膽堿和丙氨酸;區(qū)分A549和A549/IR細(xì)胞的差異代謝物是谷氨酸、谷氨酰胺、乳酸、天冬氨酸和谷胱甘肽;區(qū)分H1975細(xì)胞和H1975/IR耐藥細(xì)胞的差異代謝物是乳酸、谷氨酸、?；撬?、醋酸鹽和脯氨酸。
　　PC

12、-9/IR耐藥細(xì)胞的生長對谷氨酰胺存在濃度依賴性，促進(jìn)谷氨酰胺酶表達(dá)的c-Myc基因在PC-9/IR耐藥細(xì)胞中表達(dá)升高且?？颂婺岵荒芤种芻-Myc在PC-9/IR耐藥細(xì)胞中表達(dá)。谷氨酰胺酶抑制劑Compound968可以抑制PC-9/IR耐藥細(xì)胞在體外的增殖。
　　結(jié)論:
　　成功建立了A549/IR、H1975/IR和PC-9/IR三株耐藥細(xì)胞。研究結(jié)果提示PC-9/IR的耐藥與c-Met活化、ABCG2表達(dá)升高及代謝變化