白血病多藥耐藥細(xì)胞株K562-HHT的建立及其耐藥機(jī)制的初步研究.pdf

1、白血病 (leukemia)是臨床常見惡性腫瘤之一，化療是目前治療白血病的主要手段。白血病細(xì)胞多藥耐藥性 (multidrug resistance，MDR)的產(chǎn)生，是化療失敗的一個(gè)主要原因。高三尖杉酯堿(homoharringtonine，HHT)是我國自主研制成功的高效抗白血病藥物，系從粗榧屬植物的總生物堿中分離出的一種生物堿，是我國治療急性髓系白血病(acute myeloid leukemia)的主要藥物之一，MDR的產(chǎn)生極大的

2、影響了HHT的化療效果。目前化療藥物對白血病細(xì)胞產(chǎn)生MDR的機(jī)理尚未完全闡明，建立白血病多藥耐藥細(xì)胞系是研究白血病細(xì)胞MDR的機(jī)理及MDR逆轉(zhuǎn)機(jī)制的必要條件。本文以紅白血病細(xì)胞系K562為研究模型，在建立HHT誘導(dǎo)的多藥耐藥細(xì)胞株K562/HHT的基礎(chǔ)上，初步研究了該細(xì)胞株的生物學(xué)特性、耐藥機(jī)理及耐藥逆轉(zhuǎn)的機(jī)制。 主要研究內(nèi)容和主要結(jié)果如下： 一、白血病多藥耐藥細(xì)胞株K562/HHT的建立及其生物學(xué)特性的研究采用反復(fù)短期

3、暴露并逐漸增加HHT濃度的方法建立白血病多藥耐藥細(xì)胞株K562/RHT。MTT法檢測此耐藥細(xì)胞株對HHT的耐藥倍數(shù)及其對幾種臨床常用化療藥物的交叉耐藥性。結(jié)果顯示K562/HHT細(xì)胞株較其親代細(xì)胞K562對HHT、阿霉素、長春新堿、依托泊苷的耐藥性分別提高462.6、2.8、1183.4和2.6倍。RT-PCR法檢測細(xì)胞mdrl基因、葡萄糖神經(jīng)酰胺合成酶(Glucosylceramide synthase，GCS)基因的表達(dá)，結(jié)果顯示，

4、mdrl基因在耐藥細(xì)胞株K562/HHT中的表達(dá)較藥物敏感細(xì)胞株K562的表達(dá)明顯增高；GCS基因在耐藥細(xì)胞株K562/HHT細(xì)胞表達(dá)，在藥物敏感細(xì)胞株K562細(xì)胞未檢測到其表達(dá)。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)的表達(dá)和細(xì)胞對柔紅霉素外排能力的變化，結(jié)果顯示K562/HHT細(xì)胞P-gp表達(dá)率明顯高于K562細(xì)胞，其細(xì)胞內(nèi)柔紅霉素積累量明顯低于K562細(xì)胞。應(yīng)用免疫組化法檢測細(xì)胞bcl-2、bax

5、和caspase-3基因的表達(dá)，結(jié)果表明K562/HHT細(xì)胞bcl-2/bax比值明顯高于K562細(xì)胞，caspase-3表達(dá)率明顯低于K562細(xì)胞。K562/HHT細(xì)胞培養(yǎng)6個(gè)月后其耐藥性無明顯變化。因此，成功地建立了人白血病多藥耐藥細(xì)胞株K562/HHT，其耐藥性的產(chǎn)生可能與P-gp、GCS和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)變化有關(guān)，為進(jìn)一步研究白血病細(xì)胞多藥耐藥的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。 二、孕酮拮抗劑米非司酮(mifepristone，RU4

6、86)對K562/HHT細(xì)胞耐藥逆轉(zhuǎn)作用的研究為研究孕酮拮抗劑米非司酮可否逆轉(zhuǎn)K562/HHT細(xì)胞的多藥耐藥性，本文應(yīng)用MTI法觀察了不同濃度的RU486對K562/HHT細(xì)胞增殖的影響，以及RU486作用于K562/HHT細(xì)胞后細(xì)胞對多種化療藥物敏感性的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)10μmol/L RU486對K562/HHT細(xì)胞無明顯的殺傷作用，并能夠有效的逆轉(zhuǎn)K562/HHT細(xì)胞對HHT、阿霉素、長春新堿和依托泊苷的耐藥性。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測R

7、U486作用前后K562/HHT細(xì)胞對化療藥物柔紅霉素外排能力的變化，結(jié)果顯示RU486作用后K562/HHT 細(xì)胞內(nèi)柔紅霉素積累量明顯高于作用前。應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測RU486作用前后K562/HHT細(xì)胞bcl-2、bax和caspase-3基因的表達(dá)，結(jié)果顯示RU486作用后K562/HHT細(xì)胞bcl-2/bax比值明顯低于作用前，caspase-3表達(dá)率明顯高于作用前。表明RU486可通過促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)化療藥物積累，調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的