鼠尾草酸逆轉(zhuǎn)人白血病細(xì)胞系K562-AO2細(xì)胞多藥耐藥的作用機(jī)理.pdf

1、目的:多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)的產(chǎn)生可以使多種腫瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生交叉耐藥性是白血病化療失敗的原因。MDR產(chǎn)生的機(jī)制是較復(fù)雜，其中P-170蛋白(P-gp)是一個(gè)重要的機(jī)制，P-gp是一種能量依賴的膜溢泵，減少腫瘤細(xì)胞內(nèi)多種結(jié)構(gòu)各異的藥物濃度。P-gp調(diào)節(jié)劑具有恢復(fù)腫瘤細(xì)胞對化療藥物敏感性的作用。宿主的遺傳性或者后天的變化都可以引致獲得性耐藥的產(chǎn)生。另外，參與凋亡調(diào)控的一些信號(hào)傳導(dǎo)途徑和藥物代謝酶的

2、改變也可以引起腫瘤細(xì)胞的MDR。這些在耐藥的研究中日益受重視。鼠尾草酸(Carnosic acid，CA)是迷蝶香(Rosmarinus officinalis L)提取物中的抗氧化多酚，具有多種藥理作用，如：抗氧化、抗腫瘤、抗血栓、抗炎等。CA還可有效抑制金葡菌多藥耐藥溢出泵的作用來調(diào)節(jié)細(xì)菌的MDR，因此CA是否具有逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥的作用呢?本實(shí)驗(yàn)探討了CA對體外培養(yǎng)的人類紅白血病細(xì)胞系K562及其耐藥細(xì)胞系K562/A02多藥耐藥的

3、逆轉(zhuǎn)作用，采用分子生物學(xué)技術(shù)及人基因芯片研究人類髓性白血病發(fā)生的分子途徑，有助于揭示白血病發(fā)生的共同機(jī)制，并探討其發(fā)揮作用的分子途徑和相關(guān)機(jī)制。 方法:選用K562/A02多藥耐藥細(xì)胞系為研究對象，采用MTT法確定CA及VRP的非細(xì)胞毒性劑量：取低于10％抑制濃度(inhibiting concentration，IC<,10>)作為藥物作用濃度：CA 25umol/L。在此濃度逆轉(zhuǎn)劑作用下測定阿霉素(Adriamycin，AD

4、M)對K562及K562/A02細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC<,50>)，以此判斷CA對耐藥細(xì)胞藥物敏感性的影響。以流式細(xì)胞儀(Flow cytometry FCM)和激光掃描共聚焦顯微鏡(Laser Scanning Corlfocal Microscopy LSCM)測定CA用藥前后細(xì)胞內(nèi)ADM熒光強(qiáng)度的變化，并通過LSCM得到ADM熒光強(qiáng)度和濃度之間的線性關(guān)系，由此得到相應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)ADM濃度。通過LSCM觀測ADM在K562/A02細(xì)

5、胞內(nèi)亞細(xì)胞分布。流式細(xì)胞術(shù)檢測逆轉(zhuǎn)劑作用前后K562/A02細(xì)胞膜P-gp表達(dá)的情況。采用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)檢測多藥耐藥基因mdr1及凋亡相關(guān)基因bcl-2/bax的mRNA表達(dá)。采用Western-blot方法檢測CA處理前后P-gp蛋白在K562/A02細(xì)胞中的表達(dá)。用CA處理過的K562/A02細(xì)胞與空白的K562

6、/A02細(xì)胞的mRNA進(jìn)行實(shí)時(shí)定量RT-PCR藥物代謝基因芯片及Oligo信號(hào)傳導(dǎo)基因芯片，以探討CA對K562/A02細(xì)胞中產(chǎn)生多藥耐藥的相關(guān)基因的影響。 結(jié)果:K562/A02細(xì)胞對ADMIC<,50>為16.31ug/mL，加入CA后降至1.35ug/mL，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為12.08，與加逆轉(zhuǎn)劑之前相比具有顯著性差異(P<0.01)。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明K562/A02細(xì)胞內(nèi)ADM熒光強(qiáng)度為17.05，加入CA后，細(xì)胞內(nèi)ADM

7、熒光強(qiáng)度增至60.53，與加入逆轉(zhuǎn)劑之前相比具有顯著性差異(P<0.01)，通過LSCM可得到不同濃度的ADM熒光強(qiáng)度(y)和濃度(x)的線性方程為Y=8.47×10<'-3>x-1.34，根據(jù)LSCM檢測得到的CA處理后的K562/A02細(xì)胞內(nèi)ADM熒光強(qiáng)度可以得出細(xì)胞內(nèi)ADM的濃度，CA可將K562/A02細(xì)胞內(nèi)ADM濃度由4.86ug/mL升至15.56ug/mL，與加逆轉(zhuǎn)劑之前比較有顯著性差異(P<0.05)。ADM在K562細(xì)

8、胞內(nèi)呈彌漫性分布，而在K562/A02細(xì)胞內(nèi)主要分布在細(xì)胞核周和膜周的區(qū)域，經(jīng)CA處理后，可恢復(fù)ADM在K562/A02內(nèi)細(xì)胞核和胞漿中的彌漫分布，且可增加細(xì)胞內(nèi)ADM的聚集。流式細(xì)胞儀檢測K562/A02細(xì)胞膜上P-gp表達(dá)的熒光強(qiáng)度為44.40，加入逆轉(zhuǎn)劑CA后，細(xì)胞膜上P-gp的熒光強(qiáng)度降至23.80，加藥前后有顯著性差異(P<0.05)。RT-PCR結(jié)果顯示CA可降低mdr1及抗凋亡基因bcl-2的表達(dá)，bax的表達(dá)較加藥前增加

9、，bcl-2/bax的比值降低，加藥前后其灰度值有顯著性差異(P<0.01)。Western blot結(jié)果顯示P-gp在K562/A02細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)高表達(dá)，而在K562細(xì)胞內(nèi)幾乎沒有表達(dá)，在K562/A02細(xì)胞內(nèi)加入CA后，P-gp的表達(dá)明顯降低。在藥物代謝芯片的實(shí)驗(yàn)中，我們確定了與耐藥有關(guān)的藥物代謝酶：基因表達(dá)上調(diào)2倍的基因有35個(gè)，表達(dá)下調(diào)2倍的基因有7個(gè)。糖代謝是能量代謝的核心組成部分，糖代謝異常與許多重大疾病有密切的關(guān)聯(lián)。糖酵解是

10、腫瘤代謝的主要方式，因此糖酵解過程中的關(guān)鍵酶：己糖激酶Ⅱ(HKⅡ)，丙酮酸激酶(PK)在白血病診療中有重要的作用。CA可以抑制糖酵解途徑的關(guān)鍵酶的表達(dá)使腫瘤細(xì)胞內(nèi)糖酵解終止，抑制腫瘤細(xì)胞中的能量代謝，使腫瘤細(xì)胞由于內(nèi)能的缺乏而促使腫瘤細(xì)胞凋亡。在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)藥物芯片實(shí)驗(yàn)中，CA可以作用于與腫瘤MDR有關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的一些主要的調(diào)控分子逆轉(zhuǎn)白血病MDR，與多個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)過程有關(guān)。表達(dá)上調(diào)2倍以上的基因有25個(gè)，其中有顯著意義的基因有p300

11、/CBP，IL-4R，IRF-1，TP5313，NFKIB和v-fos等，這些基因在細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞分化和細(xì)胞凋亡等多種生理過程中發(fā)揮著重要作用。CA可引起多個(gè)信號(hào)通路的改變：p53信號(hào)通路，TGF-β信號(hào)通路，STAT通路，NF-kB信號(hào)通路及MAPK通路等，這些信號(hào)通路與腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡有密切關(guān)系，可能參與可腫瘤的化療耐藥。 結(jié)論:在體外，CA可以增加細(xì)胞內(nèi)ADM的濃度、提高耐藥細(xì)胞對ADM的敏感性、下調(diào)多藥耐藥基因m

12、drlmRNA的表達(dá)，并在下調(diào)抗凋亡基因bcl-2 mRNA的同時(shí)上調(diào)促凋亡基因bax mRNA的表達(dá)，并可以降低P-gp蛋白的表達(dá)。上述結(jié)果表明CA可以通過抑制P-gp的功能和表達(dá)達(dá)到逆轉(zhuǎn)耐藥的目的，以及調(diào)節(jié)抗凋亡基因bcl-2與促凋亡基因bax誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。CA還可以抑制腫瘤的能量來源一糖酵解途徑的關(guān)鍵酶誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時(shí)可以通過改變信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中重要的調(diào)控分子引起細(xì)胞的分化和凋亡，達(dá)到殺死腫瘤細(xì)胞的目的。由上述結(jié)果可以得知CA作為