大黃素甲醚逆轉(zhuǎn)白血病耐藥細(xì)胞系K562-ADM耐藥性的研究.pdf

1、目的：
　　本文旨在評(píng)價(jià)大黃素甲醚對(duì)慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)耐藥細(xì)胞系K562/ADM多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)作用及其機(jī)制。
　　方法：
　　1.細(xì)胞培養(yǎng)：采用腫瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)CML細(xì)胞系K562細(xì)胞與耐藥細(xì)胞系K562/ADM細(xì)胞。
　　2.CCK8（cell counting kit-8，CCK8）：檢測(cè)①K562細(xì)胞與K562/ADM細(xì)胞之間的耐藥倍

2、數(shù);②不同濃度的大黃素甲醚藥物干預(yù)后K562/ADM細(xì)胞的細(xì)胞活性;③微小RNA146a（microRNA146a，miR-146a）抑制劑(miR-146a inhibitor)及靶向CXCR4siRNA分別下調(diào)K562細(xì)胞中miR-146a及CXCR4的表達(dá)后，在阿霉素(adriamycin，ADM)的干預(yù)下K562細(xì)胞的活性;④大黃素甲醚聯(lián)合ADM對(duì)K562/ADM細(xì)胞活性的影響。
　　3.細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)：檢測(cè)大黃素甲醚聯(lián)

3、合ADM對(duì)K562/ADM細(xì)胞活性的影響。
　　4.流式細(xì)胞術(shù)及Hoechst33258檢測(cè)細(xì)胞凋亡：檢測(cè)①miR-146ainhibitor干預(yù)K562細(xì)胞后，檢測(cè)K562細(xì)胞組、K562+NC組及K562+miR-146a inhibitor組中細(xì)胞的凋亡情況;②miR-146a mimic干預(yù)K562/ADM細(xì)胞后，檢測(cè)K562/ADM細(xì)胞組、K562/ADM+NC細(xì)胞組及K562/ADM+miR-146a mimic細(xì)胞組

4、中細(xì)胞的凋亡情況;③miR-146a及趨化因子受體-4(chemokine receptor-4，CXCR4)對(duì)K562細(xì)胞凋亡的影響;④大黃素甲醚聯(lián)合ADM對(duì)K562/ADM細(xì)胞凋亡的影響;⑤降低K562/ADM細(xì)胞中miR-146a的表達(dá)后大黃素甲醚對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響。
　　5.實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)：檢測(cè)①K562細(xì)胞與K562/ADM細(xì)胞miR-

5、146a的表達(dá);②轉(zhuǎn)染miR-146a抑制劑下調(diào)K562細(xì)胞中的miR-146a的表達(dá)后各組K562細(xì)胞中miR-146a的表達(dá)情況;③K562/ADM細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-146a mimic過表達(dá)miR-146a后，各組K562/ADM細(xì)胞中miR-146a的表達(dá)情況;④下調(diào)K562細(xì)胞中的miR-146a表達(dá)后，各組K562細(xì)胞中P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gP)、多藥耐藥蛋白-1（multidrug resistan

6、t related protein，MRP-1）、CXCR4的表達(dá)情況;⑤上調(diào)K562/ADM細(xì)胞中的miR-146a的表達(dá)后，各組K562/ADM細(xì)胞中p-gP、MRP-1、CXCR4的表達(dá)情況;⑥大黃素甲醚干預(yù)下K562/ADM細(xì)胞中miR-146a的表達(dá)情況;⑦K562細(xì)胞中轉(zhuǎn)染CXCR4靶向siRNA、miR-146a抑制劑及轉(zhuǎn)染CXCR4靶向siRNA+miR-146a抑制劑后，各組細(xì)胞中CXCR4的表達(dá)情況;⑧不同濃度的大黃

7、素甲醚對(duì)K562/ADM細(xì)胞中CXCR4表達(dá)的影響。
　　6.蛋白免疫印跡：檢測(cè)①下調(diào)K562細(xì)胞中的miR-146a表達(dá)后，各組K562細(xì)胞中CXCR4的蛋白表達(dá)情況;②上調(diào)K562/ADM細(xì)胞中的miR-146a的表達(dá)后，各組K562/ADM細(xì)胞中CXCR4的蛋白表達(dá)情況;③不同濃度的大黃素甲醚干預(yù)K562/ADM細(xì)胞后，各紹細(xì)胞中CXCR4的蛋白表達(dá)情況;④K562細(xì)胞中轉(zhuǎn)染CXCR4靶向siRNA、miR-146a抑制劑及

8、轉(zhuǎn)染CXCR4靶向siRNA+miR-146a抑制劑后，各組細(xì)胞中CXCR4蛋白的表達(dá)情況。
　　7.遷移實(shí)驗(yàn)：評(píng)估K562/ADM細(xì)胞中大黃素甲醚對(duì)CXCR12結(jié)合到CXCR4的影響。
　　8.細(xì)胞表面的CXCR4：檢測(cè)①下調(diào)K562細(xì)胞中的miR-146a表達(dá)后，各組K562細(xì)胞表面CXCR4的表達(dá)情況;②上調(diào)K562/ADM細(xì)胞中的miR-146a的表達(dá)后，各組K562/ADM細(xì)胞表面CXCR4的表達(dá)情況。
　　

9、結(jié)果：
　　1、miRNA-146a在K562/ADM細(xì)胞中的表達(dá)降低
　　K562細(xì)胞和K562/ADM細(xì)胞經(jīng)ADM干預(yù)48小時(shí)后的IC50分別為0.15μM和3.5μM，表明K562/ADM的耐藥倍數(shù)是K562細(xì)胞的23倍;與K562細(xì)胞相比，K562/ADM中miR-146a的表達(dá)明顯較低。
　　2、下調(diào)miR-146a能增強(qiáng)K562細(xì)胞對(duì)ADM的耐藥性
　　轉(zhuǎn)染miR-146a抑制劑后miR-146a的表

10、達(dá)水平明顯降低;下調(diào)miR-146a后的K562細(xì)胞的生存率明顯高于正常的K562細(xì)胞及陰性對(duì)照組（IC50分別為2.8μM，0.15μM，和0.18μM。下調(diào)miR-146a能明顯增強(qiáng)K562細(xì)胞抵抗ADM誘導(dǎo)的凋亡。
　　3、上調(diào)miR-146a能使K562/ADM細(xì)胞對(duì)ADM的促凋亡更敏感
　　轉(zhuǎn)染miR-146a mimic的K562/ADM細(xì)胞中的miR-146a表達(dá)明顯增高，與K562/ADM細(xì)胞及轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒的

11、K562/ADM細(xì)胞相比能明顯增強(qiáng)K562/ADM細(xì)胞對(duì)ADM的敏感性（IC50分別為0.42μM，3.5μM及3.2μM），表明，上調(diào)miRNA-146a能使K562/ADM細(xì)胞對(duì)ADM誘導(dǎo)凋亡的作用更敏感。
　　4、miRNA-146a主要針對(duì)CXCR4參與K562細(xì)胞對(duì)ADM耐藥性
　　下調(diào)K562細(xì)胞中的miR-146a或者上調(diào)K562/ADM中的miR-146a未能引起P-gp及MRP-1的mRNA明顯改變，而且m

12、iR-146a的表達(dá)與CXCR4mRNA的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)CXCR4是miR-146a的直接目標(biāo)。靶向CXCR4siRNA能抑制細(xì)胞中CXCR4的表達(dá);miR-146a抑制劑能誘導(dǎo)CXCR4表達(dá)的上調(diào)并且能明顯地增強(qiáng)K562細(xì)胞的耐藥性。
　　5、大黃素甲醚能增強(qiáng)K562/ADM細(xì)胞對(duì)ADM的敏感性
　　大黃素甲醚對(duì)K562/ADM細(xì)胞活性的影響呈劑量依賴性;耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)在2μM和5μM的濃度下分別為2.03倍和5.3倍。與單獨(dú)

13、用ADM干預(yù)的細(xì)胞相比，當(dāng)大黃素甲醚和ADM聯(lián)合作用于K562/ADM時(shí)，細(xì)胞集落數(shù)及集落大小明顯減少。與單獨(dú)用ADM干預(yù)相比，聯(lián)合干預(yù)濃度在2μM和5μM大黃素甲醚作用于細(xì)胞后能顯著增加K562/ADM細(xì)胞的凋亡。
　　6、大黃素甲醚通過上調(diào)miR-146a和干預(yù)CXCL12/CXCR4信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)耐藥
　　大黃素甲醚干預(yù)細(xì)胞后能導(dǎo)致K562/ADM細(xì)胞中miR-146a水平呈劑量依賴性增加。大黃素甲醚增強(qiáng)K562/ADM