α-干擾素聯(lián)合全反式維甲酸逆轉(zhuǎn)人白血病細(xì)胞K562-ADM耐藥性的研究.pdf

1、目的：探討α-干擾素（interferon-α，IFN-α）和全反式維甲酸（all-trans retinoic acid，ATRA）聯(lián)合作用對耐藥白血病細(xì)胞K562/ADM耐藥性逆轉(zhuǎn)效應(yīng)及其作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.采用CCK-8法檢測K562/ADM對ADM的耐藥性；
　　2.采用CCK-8法檢測IFN-α、ATRA、IFN-α+ATRA對K562/ADM細(xì)胞生長的影響；
　　3.采用CCK-8法檢測I

2、FN-α、ATRA對K562/ADM細(xì)胞耐藥逆轉(zhuǎn)效應(yīng)；
　　4.流式細(xì)胞儀檢測IFN-α、ATRA、IFN-α+ATRA對K562/ADM細(xì)胞凋亡的影響；
　　5.流式細(xì)胞儀檢測IFN-α、ATRA、IFN-α+ATRA對K562/ADM細(xì)胞周期變化的影響；
　　6.RT-PCR法檢測IFN-α、ATRA、IFN-α+ATRA對K562/ADM細(xì)胞PI3K、Akt、Bad基因表達(dá)的影響；
　　7.Western

3、blot法檢測IFN-α、ATRA、IFN-α+ATRA對K562/ADM細(xì)胞PI3K、Akt、p-Akt、Bad蛋白表達(dá)的影響；
　　8.統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理，GraphPad Prism5軟件繪圖，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用方差分析、t檢驗及單因素方差分析等進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，顯著性水平以雙側(cè)P<0.05判斷。
　　結(jié)果：
　　1.不同濃度的ADM單藥作用K562/ADM細(xì)胞48h

4、后的IC50為23.21±2.51（mg/L）而作用K562細(xì)胞的IC50為0.43±0.04（mg/L），依據(jù)公式計算，耐藥倍數(shù)為54倍。
　　2.IFN-α對K562/ADM及K562僅有輕微抑制作用，但相同劑量對上述細(xì)胞的增殖影響無統(tǒng)計學(xué)意義。ATRA對K562/ADM和K562細(xì)胞的IC50分別為（15.72±0.67）μmol/L、（14.26±0.54）μmol/L，二者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。CCK-8實驗

5、表明，IFN-α≤2.5×106U/L，ATRA≤7.5μmol/L時無明顯毒性效應(yīng)（對細(xì)胞的增殖抑制率<10％），因此選用IFN-α2.5×106U/L，ATRA7.5μmol/L為單獨及聯(lián)合用藥時的干預(yù)濃度。
　　3.IFN-α及ATRA單獨及聯(lián)用于K562/ADM時，ADM對K562/ADM細(xì)胞的IC50分別為IFN-α組18.76±2.71（mg/L）、ATRA組9.92±1.91（mg/L）、IFN-α+ATRA組2.8

6、5±1.21（mg/L），逆轉(zhuǎn)倍數(shù)分別為1.24（P=0.001）、2.34(P=0.000)、8.14倍(P=0.000)。而對K562細(xì)胞IC50值并無明顯影響。
　　4.應(yīng)用ADM4mg/L（IC50逆轉(zhuǎn)濃度）單用或聯(lián)合IFN-α2.5×106U/L、ATRA7.5μmol/L均可使 K562/ADM細(xì)胞的凋亡率明顯增加，分別為12.58±1.88（%）、19.68±2.01（%）、38.65±2.99（%），聯(lián)合組最為顯著

7、，較比照組4.21±1.40（%）相比，存在統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.000)。
　　5.IFN-α或ATRA或聯(lián)合應(yīng)用均可導(dǎo)致K562/ADM細(xì)胞周期產(chǎn)生G0/G1期停滯，從而控制細(xì)胞的生長，將G0/G1期百分比由對照組20±0.98（%）提升至36.13±1.69（%）、42.92±3.53（%）、51.89±2.65（%）。IFN-α聯(lián)合ATRA效果較IFN-α、ATRA單用時明顯增強(qiáng)，較K562/ADM組存在統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.

8、05）。
　　6.PCR結(jié)果提示：IFN-α組、ATRA組、IFN-α聯(lián)合ATRA組PI3K基因表達(dá)明顯下調(diào)（均為P=0.000）。Akt基因無明顯變化（P=0.08，P=0.052，P=0.592，均>0.05）。IFN-α單藥并未引起B(yǎng)ad基因的顯著改變（P=0.135），但ATRA及聯(lián)合組都引起B(yǎng)ad基因上調(diào)（P=0.008，P=0.001）。
　　7.Western blot結(jié)果與PCR結(jié)果一致，IFN-α、ATRA

9、、IFN-α聯(lián)合ATRA均可引起PI3K蛋白表達(dá)明顯下調(diào)（均為P=0.000）。Akt基因無明顯變化（分別為P=0.730，P=0.573，P=0.555，均>0.05）。磷酸化Akt蛋白表達(dá)下降，當(dāng)兩藥聯(lián)用時更為顯著（分別為P=0.002，P=0.017，P=0.000）。IFN-α單藥并未引起B(yǎng)ad基因的明顯改變（P=0.054），但ATRA及聯(lián)合組均引起B(yǎng)ad基因表達(dá)上調(diào)（P=0.000，P=0.000）。
　　結(jié)論：