自噬調(diào)節(jié)全反式維甲酸誘導(dǎo)髓系白血病細(xì)胞分化的機(jī)制研究.pdf

1、急性早幼粒細(xì)胞性白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)是一類特殊的急性髓細(xì)胞性白血病(acute myeloid leukemia，AML)。PML-RARα融合蛋白導(dǎo)致APL的發(fā)生。全反式維甲酸(all-trans-retinoic acid，ATRA)可以通過PML-RARα融合蛋白降解促進(jìn)細(xì)胞分化成熟使APL達(dá)到臨床緩解。自噬能促進(jìn)PML-RARα融合蛋白的降解，但目前尚不清楚自噬參與PML-R

2、ARα融合蛋白的降解的具體機(jī)制和作用。
　　 首先，本研究以NB4細(xì)胞和HL-60細(xì)胞為研究對象，運(yùn)用免疫熒光法，Western blotting、流式細(xì)胞儀及透射電鏡分析等實(shí)驗(yàn)方法，觀察ATRA誘導(dǎo)髓系白血病細(xì)胞發(fā)生自噬的情況。研究結(jié)果顯示治療劑量下ATRA誘導(dǎo)髓細(xì)胞發(fā)生自噬；相反，添加自噬抑制劑(3-MA)后能抑制自噬的發(fā)生。進(jìn)一步利用白血病細(xì)胞系，分析了自噬相關(guān)基因在ATRA誘導(dǎo)髓系白血病細(xì)胞自噬中的作用。研究發(fā)現(xiàn)采用RN

3、A干擾技術(shù)降低自噬相關(guān)基因在細(xì)胞中的表達(dá)后，抑制了ATRA誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生的自噬，并且導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加。
　　 其次，為了進(jìn)一步探討自噬在ATRA誘導(dǎo)髓系白血病細(xì)胞分化中的作用，本研究采用流式細(xì)胞學(xué)和細(xì)胞形態(tài)學(xué)，發(fā)現(xiàn)在ATRA干預(yù)細(xì)胞時(shí)，同時(shí)加自噬抑制劑(3-MA)后能抑制ATRA誘導(dǎo)細(xì)胞分化成熟；相反，同時(shí)加自噬誘導(dǎo)劑(雷帕霉素)能促進(jìn)ATRA誘導(dǎo)細(xì)胞分化成熟。再用RNA干擾技術(shù)，抑制自噬相關(guān)基因的表達(dá)，在誘導(dǎo)分化劑作用下能有效抑

4、制髓系白血病細(xì)胞分化。以上結(jié)果證明了自噬調(diào)節(jié)ATRA誘導(dǎo)的細(xì)胞分化。
　　 最后，本研究發(fā)現(xiàn)自噬在髓系白血病細(xì)胞中調(diào)節(jié)ATRA誘導(dǎo)的PML-RARα融合蛋白降解；p62與PML-RARα融合蛋白結(jié)合調(diào)節(jié)PML-RARα融合蛋白降解和髓系白血病細(xì)胞分化。本研究先利用蛋白酶、caspases或自噬等抑制劑分別阻斷蛋白降解途徑，通過Westernblotting分析發(fā)現(xiàn)ATRA可誘導(dǎo)PML-RARα融合蛋白降解。再采用RNA干擾、免疫

5、熒光等技術(shù)，使自噬相關(guān)蛋白Atg5表達(dá)抑制，減少了PML-RARα融合蛋白降解和抑制自噬發(fā)生。然后利用免疫共沉淀技術(shù)，發(fā)現(xiàn)p62/SQSTM1與PML-RARα融合蛋白結(jié)合，免疫熒光技術(shù)顯示兩者在細(xì)胞中共定位。RNA干擾后p62表達(dá)抑制，抑制了細(xì)胞的分化和PML-RARα融合蛋白降解；相反，采用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，使p62過表達(dá)，增加PML-RARα融合蛋白傳送到溶酶體。研究顯示出細(xì)胞中適當(dāng)p62水平維持PML-RARα融合蛋白在一定水平，從

6、而調(diào)節(jié)髓系白血病細(xì)胞分化成熟，這一過程是通過蛋白酶體和自噬溶酶體兩條通路共同完成的。
　　 綜上所述，ATRA抑制mTOR通路并激活了Atg1-PI3KC3-Atg5自噬通路，此通路促進(jìn)自噬體發(fā)生；確認(rèn)了p62與PML-RARα融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)相互作用調(diào)節(jié)PML-RARα融合蛋白降解。低表達(dá)的p62抑制了PML-RARα融合蛋白的降解；相反，抑制自噬發(fā)生導(dǎo)致p62在胞內(nèi)聚集，通過一個(gè)負(fù)反饋機(jī)制抑制蛋白酶體活性和PML-RARα融