蟾蜍靈誘導(dǎo)急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞凋亡及增強(qiáng)維甲酸誘導(dǎo)分化作用機(jī)制研究.pdf

1、目的:蟾酥具有強(qiáng)心、麻醉、解毒、醒神等藥理作用，已被廣泛用于腫瘤等多種疾病的治療。蟾蜍靈(bufalin)是中藥蟾酥中分離提取的蟾蜍毒素配基之一。國(guó)外及我們的研究表明，蟾蜍靈具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖及血管生成，選擇性抑制白血病細(xì)胞在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞分化及凋亡的作用。 國(guó)外研究表明蟾蜍靈可誘導(dǎo)K562、U937等白血病細(xì)胞分化。蟾蜍靈可直接抑制細(xì)胞膜Na+/K+-ATP酶，但蟾蜍靈誘導(dǎo)K562細(xì)胞分化的能力強(qiáng)于苦毒毛旋花

2、子苷，而后者是Na+/K+-ATP酶的特異性抑制劑，提示蟾蜍靈誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化作用不僅是抑制Na+/K+-ATP，可能還有其他機(jī)制。PKC特異性抑制劑明顯降低蟾蜍靈誘導(dǎo)的成熟單核細(xì)胞標(biāo)志IL2-β基因表達(dá)，提示cPKC參與蟾蜍靈誘導(dǎo)的細(xì)胞分化。有學(xué)者報(bào)道蟾蜍靈可以恢復(fù)維甲酸耐藥的急性早幼粒細(xì)胞白血病(AcutePromyelocyticLeukemia，APL)原代培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)維甲酸的敏感性。目前有關(guān)蟾蜍靈對(duì)全反式維甲酸(ATRA)誘導(dǎo)

3、APL細(xì)胞分化的影響及相關(guān)的機(jī)制未見報(bào)道。 研究表明蟾蜍靈可抑制前列腺癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡，其機(jī)制可能與蟾蜍靈活化Caspase-3，8，9有關(guān)。有學(xué)者報(bào)道高濃度蟾蜍靈可誘導(dǎo)HL-60和U937細(xì)胞凋亡，bcl-2及c-myc基因表達(dá)降低。我們以前的研究表明，蟾蜍靈誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡時(shí)上調(diào)Smac/DIABLO蛋白表達(dá)，降低Bcl-2/Bax比值。 腫瘤細(xì)胞凋亡凋亡途徑由半胱天冬酶(Caspase)家族蛋白酶介導(dǎo)和執(zhí)

4、行。Caspase家族在細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制中作為重要的效應(yīng)子執(zhí)行凋亡。凋亡抑制蛋白(inhibitorofapoptosisprotein，IAPs)通過與Caspase相互作用來抑制細(xì)胞凋亡，生存素(Survivin)是IAPs家族成員之一，在多種腫瘤細(xì)胞以及造血系統(tǒng)惡性腫瘤均高表達(dá)。Survivin通過直接抑制Caspase-3和Caspase-7的活性發(fā)揮抗凋亡作用。我們最近的研究表明蟾蜍靈誘導(dǎo)HL-60凋亡下調(diào)Survivin基

5、因表達(dá)，活化Caspase-3。目前蟾蜍靈誘導(dǎo)APL細(xì)胞凋亡過程中的Survivin及Caspase-3的作用目前尚未見報(bào)道。 絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-ActivatedProteinKinases，MAPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)是細(xì)胞外信號(hào)引起核反應(yīng)的細(xì)胞信息傳遞的共同通路，包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(Extracellularsignal-regulatedkinases，ERK)、C-JUN氨基末端激酶(c-junN-te

6、rminalkinases，JNK)和p38絲裂原活化蛋白激酶(p38Mitogen-ActivatedProteinKinases，p38)三個(gè)主要成員。多種細(xì)胞外刺激均可將信號(hào)傳至細(xì)胞內(nèi)，引起MAPK系統(tǒng)激酶連鎖磷酸化。ERK1和ERK2是ERK中的兩個(gè)重要成員，磷酸化的ERK(P-ERK)是其活化形式，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡等生理過程。國(guó)外研究表明，在一些腫瘤細(xì)胞中，ERK抑制劑PD98059通過抑制ERK活性進(jìn)而抑制腫瘤

7、生長(zhǎng)，抑制ERK的活力可以放大紫杉醇、順鉑等化療藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用。我們以前的研究提示ERK信號(hào)途徑負(fù)向調(diào)節(jié)蟾蜍靈誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡，目前有關(guān)蟾蜍靈誘導(dǎo)APL細(xì)胞凋亡過程中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的研究并無報(bào)道。 APL占急性髓系白血病的8％～10％，早幼粒細(xì)胞白血病/維甲酸受體(PromyelocyticLeukemia-RetinoicAcidReceptoralphaPML-RARα)基因及其編碼的融合蛋白是發(fā)病的主要分子機(jī)制

8、。我國(guó)學(xué)者首次用ATRA治療APL取得巨大成功，從此腫瘤誘導(dǎo)分化療法便成為癌腫研究的一個(gè)熱點(diǎn)。ATRA誘導(dǎo)APL細(xì)胞分化可以恢復(fù)PML正常定位、促進(jìn)PML-RARα融合蛋白降解。臨床研究指出，APL用ATRA與化療合理組合治療，完全緩解(CompleteRemission，CR)率明顯提高，但緩解期短，部分患者對(duì)ATRA不敏感，易產(chǎn)生耐藥和復(fù)發(fā)，還有部分患者易并發(fā)高白細(xì)胞癥和維甲酸綜合征(RetinoicAcidSyndrome，RAS

9、)，這迫使人們對(duì)ATRA的耐藥、復(fù)發(fā)以及副作用進(jìn)行深入研究，并尋求一種新的聯(lián)合治療方案來減少?gòu)?fù)發(fā)及副作用的產(chǎn)生。國(guó)外研究表明蟾蜍靈可以逆轉(zhuǎn)APL細(xì)胞對(duì)ATRA的耐藥，恢復(fù)對(duì)ATRA的敏感性，但機(jī)制不明。 為進(jìn)一步明確蟾蜍靈誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡及促分化的確切機(jī)理，本實(shí)驗(yàn)擬采用蟾蜍靈作用于人類急性早幼粒細(xì)胞白血病NB4細(xì)胞及原代培養(yǎng)細(xì)胞，觀察蟾蜍靈對(duì)APL細(xì)胞增殖抑制、誘導(dǎo)凋亡作用，進(jìn)一步研究蟾蜍靈在誘導(dǎo)凋亡過程中對(duì)Survivin基

10、因表達(dá)及Caspase-3的影響，闡述MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在蟾蜍靈誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中的作用，深入探討蟾蜍靈對(duì)ATRA誘導(dǎo)APL細(xì)胞分化作用的影響及可能機(jī)制。 方法1.細(xì)胞增殖測(cè)定：采用臺(tái)盼藍(lán)拒染法，繪制增殖曲線。 2.細(xì)胞凋亡的檢測(cè)：Wright-Giemsa染色形態(tài)學(xué)分析，流式細(xì)胞儀進(jìn)行DNA含量檢測(cè)細(xì)胞凋亡。 3.細(xì)胞誘導(dǎo)分化的檢測(cè)：通過形態(tài)學(xué)分析、NBT還原試驗(yàn)、細(xì)胞表面標(biāo)記抗原CD11b采用流式細(xì)胞儀解析

11、。 4.SurvivinmRNA及PML/RARαmRNA表達(dá)采用RT-PCR檢測(cè)。 5.Survivin、Caspase-3蛋白及p-ERK1/2蛋白采用WesternBlot檢測(cè)。 6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)用3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值表示，結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析，用SPSS11.5forWindows統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。 結(jié)論:1.蟾蜍靈以時(shí)間、劑量依賴的方式抑制NB4細(xì)胞增殖，高濃度時(shí)誘導(dǎo)NB4細(xì)胞凋亡

12、，下調(diào)SurvivinmRNA及蛋白表達(dá)，并活化Caspases-3，提示蟾蜍靈誘導(dǎo)的NB4細(xì)胞凋亡可能與下調(diào)Survivin基因表達(dá)及活化Caspase-3有關(guān)。 2.抑制ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路增強(qiáng)蟾蜍靈誘導(dǎo)NB4細(xì)胞凋亡作用，并進(jìn)一步下調(diào)Survivin表達(dá)、活化Caspase-3，提示ERK途徑可能參與了蟾蜍靈誘導(dǎo)NB4細(xì)胞凋亡，抑制該途徑，可起到增強(qiáng)蟾蜍靈誘導(dǎo)凋亡作用。 3.蟾蜍靈低濃度時(shí)增強(qiáng)ATRA對(duì)NB4及APL