依維莫司協(xié)同全反式維甲酸對(duì)耐藥急性早幼粒細(xì)胞白血病的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　急性早幼粒細(xì)胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)是髓系細(xì)胞停止在早幼粒細(xì)胞階段的一類(lèi)較為特殊的急性髓系白血病。隨著全反式維甲酸（all-trans retinoid acid，ATRA）常規(guī)用于APL的治療后，APL患者的預(yù)后得到了顯著提高。但是，單用ATRA后耐藥問(wèn)題也日益嚴(yán)重。依維莫司(Everolimus，RAD001)一種新型哺乳動(dòng)物雷帕霉素受體(mTOR)抑制劑，為雷帕

2、霉素的衍生物，具有免疫抑制、抗腫瘤、抗病毒等多種作用。因此，本研究旨在探討依維莫司協(xié)同ATRA對(duì)APL的作用及機(jī)制。
　　方法:
　　用RAD001和ATRA分別或聯(lián)合處理急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株NB4-R1細(xì)胞。應(yīng)用CD11b染色流式細(xì)胞術(shù)及硝基四唑氮藍(lán)(NBT)還原實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞分化，運(yùn)用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，周期試劑盒流式檢測(cè)細(xì)胞周期情況，AnnexinⅤ/PI雙染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，免疫印跡法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白

3、LC3、Beclin1，凋亡相關(guān)蛋白caspase家族，周期相關(guān)蛋白CyclinD1、P27Kip1及其他P70S6K、P-P70S6K、4E-BP1、P-4E-BP1、PML-RARα等蛋白質(zhì)表達(dá)水平，RT-PCR方法檢測(cè)分化相關(guān)基因C/EBPε的mRNA表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　(1)用1nM、10nM、100nM的RAD001和1μM的ATRA分別或聯(lián)合處理 NB4-R1細(xì)胞24h、48h、72h后。流式細(xì)胞術(shù)和NB

4、T還原實(shí)驗(yàn)顯示，聯(lián)合用藥組能夠明顯誘導(dǎo)NB4-R1細(xì)胞的分化，而單獨(dú)使用RAD001或ATRA并不能有效誘導(dǎo)NB4-R1細(xì)胞的分化。其中100nM的RAD001聯(lián)合1μM的ATRA和單獨(dú)1μM的ATRA處理NB4-R1細(xì)胞48h后分化比率分別為（54.47±4.91）％和（17.07±2.65）％(p＜0.01)。
　　(2)用1nM、10nM、100nM的RAD001和1μM的ATRA分別或聯(lián)合處理NB4-R1細(xì)胞48h后。CC

5、K-8法檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞的增殖情況發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合用藥明顯抑制細(xì)胞的增殖(p＜0.01)，并且隨著聯(lián)用RAD001的濃度的增加，抑制作用也逐漸增強(qiáng)。而單獨(dú)用藥對(duì)細(xì)胞的抑制作用不明顯。
　　(3)用濃度為100nM的RAD001和1μM的ATRA分別或聯(lián)合處理APL細(xì)胞株NB4-R1細(xì)胞48h后，流式細(xì)胞術(shù)周期檢測(cè)聯(lián)合用藥組G1期細(xì)胞明顯增多，而S期細(xì)胞明顯減少(p＜0.05)。免疫印跡法結(jié)果顯示聯(lián)合用藥后細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclinD1表

6、達(dá)相對(duì)單獨(dú)用ATRA組明顯下調(diào)，而P27Kip1蛋白表達(dá)水平上調(diào)。
　　(4)用濃度為100nM的RAD001和1μM的ATRA分別或聯(lián)合處理APL細(xì)胞株NB4-R1細(xì)胞48h后，流式細(xì)胞術(shù)凋亡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥組和單獨(dú)用藥組細(xì)胞并未發(fā)生明顯凋亡。免疫印跡法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Caspase家族caspase3、caspase8、caspase9發(fā)現(xiàn)各組之間并未發(fā)生明顯變化。
　　(5)用濃度為100nM的RAD001和1μM的A

7、TRA分別或聯(lián)合處理APL細(xì)胞株NB4-R1細(xì)胞48h后，RT-PCR檢測(cè)分化相關(guān)基因C/EBPε的mRNA水平顯示聯(lián)合用藥組相對(duì)與單獨(dú)用藥組明顯上調(diào)(p＜0.01)。免疫印跡檢測(cè)PML-RARα融合蛋白發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合用藥使融合蛋白表達(dá)下降，RAD001協(xié)同ATRA明顯抑制了mTOR下游底物P70S6K、4E-BP1的磷酸化，自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ、Beclin1表達(dá)明顯上調(diào)。而加入10mM的自噬抑制劑3-MA處理后，APL細(xì)胞株NB4-R

8、1細(xì)胞分化水平明顯下降(p＜0.01)并且可逆轉(zhuǎn)聯(lián)合用藥對(duì)PML-RARα融合蛋白的部分降解作用。
　　結(jié)論:
　　(1) RAD001協(xié)同ATRA可以誘導(dǎo)耐藥的急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株 NB4-R1細(xì)胞分化，達(dá)到逆轉(zhuǎn)其耐藥的作用。可能是通過(guò)上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子C/EBPε的表達(dá)和抑制mTOR信號(hào)通路誘導(dǎo)NB4-R1發(fā)生自噬部分降解PML-RARα融合蛋白等多種途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
　　(2) RAD001協(xié)同ATRA明顯抑制NB