CDK2泛素化降解在全反式維甲酸誘導(dǎo)急性髓性白血病細(xì)胞分化中的作用研究.pdf

1、研究目的:
　　 急性髓性白血病(acutemyeloidleukemia,AML)的重要標(biāo)志為嚴(yán)重的髓系分化障礙,因此誘導(dǎo)分化治療是目前公認(rèn)的針對(duì)AML的有效治療策略。利用全反式維甲酸(all-transretinoicacid,ATRA)治療早幼粒細(xì)胞白血病(acutepromyeloidleukemia,APL,M3型AML)是誘導(dǎo)分化治療策略用于臨床實(shí)踐的最成功范例。由于ATRA在臨床應(yīng)用上的巨大成功,深入研究ATRA誘

2、導(dǎo)細(xì)胞分化的分子機(jī)制,進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)分化治療的潛在靶標(biāo),完善誘導(dǎo)分化治療策略是許多腫瘤學(xué)家追求的重要目標(biāo)。
　　 現(xiàn)代分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)ATRA誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化過程中往往伴隨有細(xì)胞退出增殖周期,即細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期。因此細(xì)胞周期調(diào)控因子在ATRA誘導(dǎo)分化中的作用成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道,細(xì)胞周期蛋白依賴激酶活化激酶(Cyclin-dependentkinase-activatingkinase,CAK

3、)、細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)、p21WAF1/Cip-1、p27Kipl和CyclinE等都被認(rèn)為在ATRA誘導(dǎo)細(xì)胞分化過程中發(fā)揮重要作用.但細(xì)胞周期蛋白依賴激酶(Cyclin-dependentkinases,CDKs)是否在該過程中發(fā)揮作用目前仍無文獻(xiàn)報(bào)道。
　　 細(xì)胞周期蛋白依賴激酶2(Cyclin-dependentkinase2,CDK2)屬于CDK絲氨酸/蘇氨酸激酶家族,是細(xì)胞G1/S期轉(zhuǎn)換過程中的重要調(diào)

4、控因子。CDK2可分別結(jié)合于CyclinE和CyclinA,隨后CAK磷酸化其蘇氨酸160位(Thr-160)而被激活,通過磷酸化眾多底物而促進(jìn)G1/S期的進(jìn)程。然而除在細(xì)胞周期中發(fā)揮重要作用外,近年來CDK2也被發(fā)現(xiàn)在調(diào)控細(xì)胞自我更新和分化中起到關(guān)鍵作用。一些文獻(xiàn)報(bào)道CDK2活性或表達(dá)可促進(jìn)鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)祖細(xì)胞和成年小鼠的髓鞘等的分化。
　　 泛素蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-protea

5、somesystem,UPS)是真核細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)選擇性降解的重要途徑。通過選擇性降解并調(diào)控細(xì)胞內(nèi)蛋白,UPS廣泛地參與細(xì)胞的生長、分化、凋亡、周期調(diào)控、炎癥反應(yīng)等重要的生命活動(dòng)過程。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),ATRA誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化和G0/G1周期阻滯的過程中伴隨有CDK2蛋白水平的明顯下降,而同時(shí)抑制蛋白酶體活性,CDK2下調(diào)的趨勢被明顯逆轉(zhuǎn),提示CDK2在ATRA作用后可能通過UPS發(fā)生降解。關(guān)于CDK2的降解機(jī)制及其在ATRA誘導(dǎo)細(xì)

6、胞分化中的作用目前均尚無文獻(xiàn)報(bào)道。
　　 因此,本課題的研究將分兩部分探討ATRA誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化中UPS介導(dǎo)的CDK2的降解:1)確證ATRA促進(jìn)CDK2通過UPS發(fā)生降解,并探討其調(diào)控機(jī)制;2)研究CDK2降解對(duì)ATRA誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化的影響,并探索相關(guān)分子機(jī)制。研究方法:
　　 1)選用人白血病細(xì)胞株NB4和U937為主要研究對(duì)象,考察ATRA誘導(dǎo)細(xì)胞分化過程中CDK2泛素化降解的情況:細(xì)胞經(jīng)CD11b-PE抗

7、體孵育后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面分化抗原CD11b表達(dá);應(yīng)用瑞氏.吉姆薩染色觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變;應(yīng)用碘化丙啶(propidiumiodide,PI)染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布;應(yīng)用Real-timePCR檢測細(xì)胞中CDK2mRNA水平變化;應(yīng)用’western-blot檢測CDK2及p-CDK2(Thr-160)蛋白水平變化;應(yīng)用免疫熒光法檢測細(xì)胞內(nèi)CDK2與泛素蛋白(Ubiquitin,Ub)的共定位變化;采用免疫沉淀法檢測

8、CDK2與Ub的結(jié)合水平;選用COS-7細(xì)胞為瞬時(shí)表達(dá)宿主,共轉(zhuǎn)染CDK2/CDK2-T160A和Ub考察CDK2和CDK2-T160A的泛素化降解情況.采用TNT(R)兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)錄/翻譯偶聯(lián)系統(tǒng)體外表達(dá)CDK2重組蛋白。
　　 2)選用人AML細(xì)胞株NB4為主要研究對(duì)象,考察細(xì)胞內(nèi)CDK2蛋白水平下降對(duì)ATRA誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化作用的影響:采用臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)合血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)觀察細(xì)胞增殖情況和細(xì)胞存活率,描繪細(xì)胞增殖曲

9、線;細(xì)胞經(jīng)CD11b-PE抗體孵育后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面分化抗原CD11b表達(dá);應(yīng)用瑞氏-吉姆薩染色觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變;采用硝基四氮唑藍(lán)(NBT)測試細(xì)胞還原能力;采用PI染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布的變化;應(yīng)用western-blot檢測CDK2蛋白,細(xì)胞周期蛋白(CyclinE、CyclinA),分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)(p-STAT1Try701,STAT1、PU.1、C/EBPβ)的表達(dá)情況;應(yīng)用Real-timePC

10、R檢測細(xì)胞內(nèi)以上蛋白和粒性細(xì)胞特異性表達(dá)的CSF3R的mRNA表達(dá)水平。
　　 研究結(jié)果:
　　 第一部分:ATRA促進(jìn)CDK2通過泛素蛋白酶體途徑降解
　　 1)藥物誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化和G0/G1期阻滯過程中CDK2發(fā)生明顯下調(diào)
　　 檢測細(xì)胞分化特異性表面抗原CD11b的表達(dá),結(jié)果顯示ATRA能夠誘導(dǎo)NB4和U937細(xì)胞發(fā)生髓系分化,且呈時(shí)間依賴性關(guān)系。瑞氏-吉姆薩染色結(jié)果表明ATRA作用72小時(shí)后,

11、NB4細(xì)胞分化為成熟粒細(xì)胞,U937細(xì)胞分化為成熟單核/巨噬細(xì)胞。PI染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)的檢測發(fā)現(xiàn),ATRA能夠誘導(dǎo)NB4細(xì)胞和U937細(xì)胞發(fā)生時(shí)間依賴性的G0/G1期阻滯。Western-blot檢測結(jié)果顯示,ATRA作用后,NB4細(xì)胞和U937細(xì)胞中CDK2蛋白水平呈現(xiàn)逐漸下調(diào)趨勢,且與細(xì)胞的分化和周期阻滯進(jìn)程高度一致。此外,在TPA和DMSO誘導(dǎo)NB4細(xì)胞分化和G0/G1期阻滯的過程中,CDK2蛋白水平亦發(fā)生明顯下調(diào),而采用周期同

12、步化手段使細(xì)胞分布于不同周期階段時(shí)CDK2水平則無明顯變化,進(jìn)一步提示CDK2蛋白下調(diào)與ATRA誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化之間的密切關(guān)系。
　　 2)AML細(xì)胞分化過程中CDK2的下調(diào)依賴于蛋白酶體通路
　　 3)CDK2在不同體系中通過泛素蛋白酶體途徑發(fā)生降解
　　 4)ATRA誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化過程中促進(jìn)CDK2通過UPS途徑降解
　　 5)CDK2的160位點(diǎn)蘇氨酸磷酸化水平對(duì)CDK2泛素化的影響
　

13、　 第二部分:CDK2降解在全反式維甲酸誘導(dǎo)急性髓性白血病細(xì)胞分化中的作用及機(jī)制研究
　　 1)CDK2蛋白水平的下降增強(qiáng)ATRA誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化的作用
　　 利用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)將攜帶CDK2shRNA的質(zhì)粒pLKO.1-CDK2＃1shRNA和pLKO.1-CDK2＃5shRNA以及相應(yīng)的質(zhì)粒空載pLKO.1(Vector)轉(zhuǎn)入NB4細(xì)胞,篩選并構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株。Western-blot檢測結(jié)果顯示與質(zhì)?？蛰d相

14、比,pLKO.1-CDK2＃1shRNA的沉默CDK2表達(dá)的效率接近100％,pLKO.1-CDK2＃5shRNA的沉默效率約為60%。
　　 2)CDK2蛋白水平下調(diào)協(xié)同ATRA誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化的機(jī)制研究
　　 細(xì)胞周期同步化實(shí)驗(yàn)結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布的結(jié)果顯示,NB4-Vector和NB4-CDK2shRNA細(xì)胞在同步化后細(xì)胞周期G0/G1、S、G2/M的進(jìn)程均無明顯差異,表明CDK2蛋白水平的下調(diào)并不影響

15、NB4細(xì)胞的周期進(jìn)程。ATRA作用于NB4-Vector和NB4-CDK2shRNA細(xì)胞后不同時(shí)間檢測細(xì)胞周期分布,發(fā)現(xiàn)兩組細(xì)胞均出現(xiàn)明顯的G0/G1期阻滯,但無論在ATRA處理前或處理后,二者的周期分布情況無顯著差異.上述結(jié)果表明,細(xì)胞內(nèi)CDK2蛋白水平的下降對(duì)NB4細(xì)胞的細(xì)胞周期無影響,同時(shí)對(duì)ATRA誘導(dǎo)NB4細(xì)胞G0/G1阻滯的作用亦無影響,提示CDK2蛋白下調(diào)所引起的ATRA誘導(dǎo)細(xì)胞分化作用的增強(qiáng)并非由其促進(jìn)細(xì)胞周期阻滯的作用引

16、起。
　　 結(jié)論:本論文較為系統(tǒng)的探討了ATRA分化誘導(dǎo)治療AML過程中UPS介導(dǎo)的CDK2降解,并對(duì)其作用和相關(guān)機(jī)制進(jìn)行了探討。首先,我們首次證實(shí)CDK2可作為UPS途徑的底物而被降解,ATRA在誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化過程中促進(jìn)CDK2通過UPS途徑發(fā)生降解。其次,CDK2的降解能夠促進(jìn)ATRA誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化的作用,且這種促進(jìn)作用并非由促進(jìn)細(xì)胞退出增殖周期所介導(dǎo),而是通過直接調(diào)控分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)而實(shí)現(xiàn)。本文闡述了CD