microRNA在急性白血病的分類和預(yù)后作用及在高三尖杉酯堿誘導(dǎo)急性髓系白血病細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制.pdf

1、本研究分為三部分：
　　 第一部分：microRNA在急性白血病中的分類及預(yù)后中的作用
　　 目的：
　　 觀察23種前體miRNAs在85例初發(fā)未治急性白血病中的表達(dá)，探討miRNAs在急性白血病中分類及與預(yù)后的關(guān)系。
　　 方法：
　　 采用逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)23種miRNAs在初發(fā)未治急性白血病患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)，并對(duì)患者的生存期進(jìn)行隨訪。
　　 結(jié)果：

2、　　 ①16個(gè)miRNAs在85例AML與ALL中差異表達(dá)，9種miRNAs在ALL中表達(dá)明顯高于AML，而7種miRNAs在AML表達(dá)明顯高于ALL。②32例ALL患者中miR-146a、miR-181a/c和miR-221與ALL患者的總生存期相關(guān)：miR-146a、miR-181a/c高表達(dá)的患者的生存期短，而miR-221高表達(dá)患者有更長(zhǎng)的生存期。③5種miRNAs表達(dá)水平與53例AML患者生存期有顯著相關(guān)。miR-25的表達(dá)

3、水平與生存期呈正相關(guān)，另4種表達(dá)水平與生存期呈負(fù)相關(guān)。對(duì)其中的40例非M3亞型的AML病例進(jìn)行分析，3種miRNAs的表達(dá)水平與生存期均呈負(fù)相關(guān)。④考慮到miR-146a是我們研究的23個(gè)miRNAs中唯一一個(gè)與AML和ALL患者總生存期相關(guān)的miRNA，追加檢測(cè)了61例初發(fā)未治AML患者骨髓標(biāo)本miR-146a，結(jié)果顯示miR-146a低表達(dá)患者生存期長(zhǎng)。⑤通過(guò)檢索國(guó)際上5個(gè)主要的miRNA靶基因數(shù)據(jù)庫(kù)，我們發(fā)現(xiàn)miR-146a共有約

4、7200個(gè)可能的靶基因。
　　 結(jié)論：
　　 ①9種miRNAs在ALL中表達(dá)明顯高于AML;而7個(gè)miRNAs在AML表達(dá)明顯高于ALL。
　　 ②miR-146a、miR-181a/c高表達(dá)的ALL患者的生存期短，而miR-221高表達(dá)的ALL患者生存期長(zhǎng)。
　　 ③miR-25的表達(dá)水平與AML患者生存期呈正相關(guān)，miR-26a、miR-29b、miR-146a、miR-196b表達(dá)水平與AML患者

5、生存期呈負(fù)相關(guān)。miR-26a、miR-29b、miR-146a的表達(dá)水平與非M3亞型的AML患者生存期均呈負(fù)相關(guān)。
　　 ④在基因本體論生物過(guò)程部分，與被預(yù)測(cè)的27901個(gè)人類可能受miRNA調(diào)控的基因相比，622個(gè)miR-146a的可能靶基因中與負(fù)性調(diào)控生物學(xué)過(guò)程、陰性調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期、細(xì)胞周期關(guān)卡、細(xì)胞周期停滯和DNA損害檢查點(diǎn)相關(guān)的基因比例明顯提高。miR-146a高表達(dá)的患者臨床預(yù)后相對(duì)差，可能與miR-1

6、46a高表達(dá)后抑制了靶基因表達(dá)有關(guān)。
　　 第二部分：microRNA在高三尖杉酯堿誘導(dǎo)急性髓系白血病細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制
　　 目的：
　　 探討microRNA在高三尖杉酯堿誘導(dǎo)急性髓系白血病細(xì)胞凋亡中表達(dá)變化，并初步探討其作用機(jī)制。
　　 方法：
　　 采用MTT比色法研究HHT對(duì)K562、HL60、U937細(xì)胞的體外生長(zhǎng)抑制作用；采用流式細(xì)胞儀PI染色檢測(cè)細(xì)胞周期和Annexin V/PI

7、雙染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡；采用miRNA芯片技術(shù)檢測(cè)HHT作用K562細(xì)胞后miRNA表達(dá)的變化；采用real-time PCR技術(shù)檢測(cè)HHT對(duì)K562、HL60、U937細(xì)胞成熟miRNA表達(dá)的影響；采用real-time PCR技術(shù)檢測(cè)HHT對(duì)K562、HL60、U937細(xì)胞及原代AML細(xì)胞miR-17-92表達(dá)的影響；采用real-time PCR技術(shù)檢測(cè)HHT對(duì)K562、U937細(xì)胞C-Myc和p21mRNA表達(dá)水平的影響；采用Wes

8、tern Blot技術(shù)檢測(cè)K562和U937細(xì)胞miR-17-92基因簇相關(guān)基因蛋白水平表達(dá)；采用Western Blot技術(shù)檢測(cè)HHT作用K562細(xì)胞后bcr/abl P210蛋白和Bcl-2家族蛋白水平表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：
　　 ①HHT抑制人AML細(xì)胞株K562、HL60、U937細(xì)胞的生長(zhǎng)，均呈濃度和時(shí)間依賴性。②HHT對(duì)K562細(xì)胞無(wú)明顯的周期抑制作用，HHT能誘導(dǎo)K562、HL60、U937細(xì)胞凋亡，并呈

9、濃度依賴性。③共檢測(cè)了600多個(gè)人miRNAs表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)有13種miRNAs在HHT作用后3個(gè)時(shí)間點(diǎn)均表達(dá)下調(diào)，與對(duì)照組相比差異大于1.5倍，未發(fā)現(xiàn)3個(gè)時(shí)間點(diǎn)均表達(dá)上調(diào)的miRNA。進(jìn)一步通過(guò)real-time PCR驗(yàn)證，HHT能下調(diào)K562、HL60、U937細(xì)胞13種成熟miRNA的表達(dá)。④HHT能明顯下調(diào)K562、HL60、U937和3例原代AML細(xì)胞miR-17-92基因簇的初級(jí)轉(zhuǎn)錄本表達(dá)。⑤HHT下調(diào)K562、U937細(xì)

10、胞C-Myc mRNA表達(dá)，并上調(diào)p21mRNA表達(dá)。⑥HHT能下調(diào)K562、U937細(xì)胞P-AKT和c-Myc蛋白的表達(dá)，上調(diào)p21、PTEN、P-PTEN和E2F1蛋白的表達(dá)，而BIM和總AKT則無(wú)明顯變化。⑦HHT作用K562細(xì)胞24h后，bcr/abl P210蛋白表達(dá)才明顯下調(diào)，而促凋亡蛋白Bak、Bax表達(dá)上調(diào)，抗凋亡蛋白Bcl-xl和Mcl-l表達(dá)下調(diào)。
　　 結(jié)論：
　　 ①HHT可以抑制人AML細(xì)胞株細(xì)

11、胞的增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　　 ②HHT能下調(diào)人AML細(xì)胞13種miRNA的成熟體表達(dá)，其下調(diào)miR-17-92基因簇miRNA表達(dá)是先通過(guò)下調(diào)c-Myc表達(dá)，進(jìn)而下調(diào)miR-17-92基因簇的前體轉(zhuǎn)錄本表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。HHT作用24h后才明顯下調(diào)K562細(xì)胞bcr/ablP210蛋白表達(dá)，說(shuō)明HHT下調(diào)K562細(xì)胞的c-Myc表達(dá)可能并不通過(guò)bcr/abl P210融合蛋白。
　　 ③HHT上調(diào)AML細(xì)胞miR-17-92

12、基因簇及其兩個(gè)旁系同源體的共同靶基因p21、PTEN、和E2F1蛋白表達(dá)，并抑制PTEN下游AKT磷酸化，上調(diào)p21蛋白表達(dá)可能與p21mRNA表達(dá)上調(diào)有關(guān)。這些靶基因表達(dá)上調(diào)可能與HHT下調(diào)miR-17-92基因簇及其兩個(gè)旁系同源體的相關(guān)miRNAs表達(dá)有關(guān)。
　　 ④HHT還可以通過(guò)上調(diào)K562細(xì)胞的Bcl-2家族中促凋亡蛋白Bak、Bax表達(dá)，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-xl和Mcl-1表達(dá)誘導(dǎo)AML細(xì)胞凋亡。
　　 第

13、三部分 miR-17-92基因及miR-17、miR-20a的類似物和抑制劑轉(zhuǎn)染及作用機(jī)制
　　 目的：
　　 通過(guò)基因轉(zhuǎn)染進(jìn)一步研究miR-17-92、miR-17、miR-20a在HHT誘導(dǎo)AML細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制。
　　 方法：
　　 通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將miR-17-92基因轉(zhuǎn)染進(jìn)入K562和U937細(xì)胞；采用電轉(zhuǎn)法分別將miR-17和miR-20a的模擬物和抑制劑轉(zhuǎn)染進(jìn)入K562細(xì)胞；采用We

14、stern Blot技術(shù)檢測(cè)相關(guān)靶基因表達(dá)變化；采用real-time PCR技術(shù)檢測(cè)p21基因表達(dá)變化及miRNA表達(dá)變化；采用Annexin V/PI雙染色方法檢測(cè)HHT對(duì)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡影響。
　　 結(jié)果：
　　 ①轉(zhuǎn)染miR-17-92基因后，與對(duì)照細(xì)胞相比，K562和U937細(xì)胞的p21、E2F1和PTEN蛋白表達(dá)下調(diào)，p21mRNA表達(dá)下調(diào)。50ng/ml HHT處理轉(zhuǎn)染了miR-17-92基因的K562和U9

15、37細(xì)胞24h后，與對(duì)照細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞早期凋亡細(xì)胞比例明顯下降。②K562細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-17和miR-20a的模擬物后，與對(duì)照細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染后p21、E2F1和PTEN蛋白表達(dá)下調(diào)，p21mRNA表達(dá)下調(diào)。K562細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-17和miR-20a的抑制劑后，與對(duì)照細(xì)胞相比，p21、E2F1和PTEN蛋白表達(dá)上調(diào)，p21mRNA表達(dá)上調(diào)。50ng/ml HHT處理K562細(xì)胞24h后，與對(duì)照細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染miR-17/miR-

16、20a模擬物后K562細(xì)胞早期凋亡比例明顯下降，轉(zhuǎn)染miR-17/miR-20a抑制劑后K562細(xì)胞早期凋亡比例明顯上升。
　　 結(jié)論：
　　 ①在K562和U937細(xì)胞中，p21、E2F1和PTEN是miR-17-92基因簇的靶基因。
　　 ②在K562細(xì)胞中，p21、E2F1、PTEN表達(dá)分別受miR-17和miR-20a調(diào)節(jié)，是miR-17和miR-20a的靶基因。
　　 ③結(jié)合第二部分結(jié)果，說(shuō)明H

17、HT先下調(diào)了AML細(xì)胞的miR-17-92基因的表達(dá)，進(jìn)而降低了miR-17和miR-20a的表達(dá)，導(dǎo)致靶基因p21、E2F1、PTEN表達(dá)上調(diào)，從而促進(jìn)AML細(xì)胞凋亡。
　　 ④提高miR-17-92、miR-17、miR-20a表達(dá)均可抑制AML細(xì)胞對(duì)HHT的敏感性；抑制miR-17或miR-20a功能可促進(jìn)AML細(xì)胞對(duì)HHT的敏感性。
　　 總結(jié)：
　　 HHT能誘導(dǎo)人AML細(xì)胞凋亡并下調(diào)AML細(xì)胞13種m

18、iRNAs表達(dá)。HHT下調(diào)AML細(xì)胞miR-17-92基因簇的正向轉(zhuǎn)錄因子C-Myc蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致miR-17-92基因簇表達(dá)下調(diào)。miR-17-92基因簇表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致miR-17、miR-20a低表達(dá)。HHT通過(guò)降低miR-17、miR-20a等miRNA表達(dá)，上調(diào)了其靶基因p21、E2F1、PTEN表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)AML細(xì)胞凋亡。因而我們認(rèn)為miR-17-92基因簇及其兩個(gè)旁系同源體的一些miRNAs，共同通過(guò)靶基因p21、E2F1