髓系白血病干-祖細(xì)胞的集落培養(yǎng)及體外分化研究.pdf

1、研究背景及目的：急性髓系白血病(AML)干/祖細(xì)胞的研究與造血干細(xì)胞(HSC)的研究密不可分。1961年人們提出HSC的概念，開創(chuàng)了干細(xì)胞生物學(xué)的研究領(lǐng)域，1994年Lapidot等首次通過特異細(xì)胞表面標(biāo)志分離出了人AML的白血病干細(xì)胞(LSC)，發(fā)現(xiàn)只有LSC才具有不斷自我更新并維持其惡性顯型的作用，證明了腫瘤干細(xì)胞(CSC)的客觀存在。研究表明LSC的特異細(xì)胞表型為CD34<'+>/CD38<'->或CD34<'+>/HLA-DR<

2、'->。除急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL)以外，幾乎所有的AML亞型均與LSC相關(guān)。干細(xì)胞(SC)具有自我更新及定向分化的特性。上世紀(jì)80年代中期我國(guó)學(xué)者成功使用藥物將APL的原始細(xì)胞誘導(dǎo)為成熟細(xì)胞，開創(chuàng)了原始白血病細(xì)胞分化研究的先河。目前，LSC體外分析方法主要是白血病干/祖細(xì)胞集落(CFU-L)形成能力測(cè)定法。從SC到祖細(xì)胞(PC)及成熟細(xì)胞的增殖、分化、凋亡在很大程度上是多種細(xì)胞因子通過多種形式的相互作用調(diào)控的。 本課題研究

3、的目的為觀察白血病細(xì)胞在特定的體外培養(yǎng)條件下，通過加入IL-3、IL-6、SCF、GM-CSF及G-CSF等細(xì)胞因子誘導(dǎo)髓系白血病干/祖細(xì)胞向成熟粒細(xì)胞分化。 方法：本實(shí)驗(yàn)分為三部分。 第一部分：包括兩個(gè)預(yù)實(shí)驗(yàn)，均在相同的CF[J—L培養(yǎng)條件下完成，該培養(yǎng)條件是由Agar、McCoy’5A培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)及滋養(yǎng)層細(xì)胞(經(jīng)<'60>CO輻射的正常人外周血白細(xì)胞)共同構(gòu)成的混合體系，簡(jiǎn)稱為Agar半固體培養(yǎng)基。

4、 實(shí)驗(yàn)分別為： 1、AML患者骨髓(BM)單個(gè)核細(xì)胞(MNC)與正常人BM MNC集落生長(zhǎng)對(duì)照實(shí)驗(yàn)：在上述CFU-L培養(yǎng)條件下，經(jīng)IL-3、GM-CSF及SCF刺激的AMI，BM MNC與正常人BM MNC進(jìn)行集落培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)第0d、2d、5d及7d對(duì)集落計(jì)數(shù)，進(jìn)行對(duì)照研究。 2、新鮮AML BM MNC與液氮凍存AML BM MNC集落生長(zhǎng)對(duì)照實(shí)驗(yàn)：在相同CFU-L培養(yǎng)條件下，經(jīng)IL-3、IL-6、SCF、GM

5、-CSF及G-CSF刺激的新鮮AML BM MNC與液氮凍存AML BM MNC進(jìn)行集落培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)第0d、2d、5d及7d對(duì)集落計(jì)數(shù)，進(jìn)行對(duì)照研究； 第二部分：髓系白血病干/祖細(xì)胞的集落培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)： 在IL-3、SCF、GM-CSF等細(xì)胞因子的刺激下，AML BM MNC在上述Agar半固體培養(yǎng)基上進(jìn)行集落培養(yǎng)，并對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)和細(xì)胞免疫分型的鑒定，以確定其是否為CFU-L。 第三部分：髓系白血病干/祖細(xì)

6、胞的體外分化實(shí)驗(yàn)： CFU-L的細(xì)胞分別接種于含與不含。FBS的McCoy’s5A培養(yǎng)基中，加入IL-3、IL-6、SCF、GM-CSF及G-CSF等細(xì)胞因子進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)其向成熟粒細(xì)胞分化，將培養(yǎng)至20d時(shí)收獲的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)和細(xì)胞免疫分型的鑒定，以確定其是否為成熟粒細(xì)胞。 結(jié)果： 第一部分： 1、顯微鏡觀察：正常人BM MNC在Agar半固體培養(yǎng)基上不形成集落，而AML BM MNC可以在培養(yǎng)第2

7、天時(shí)開始出現(xiàn)，到第七天時(shí)集落數(shù)達(dá)到300-500個(gè)；統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用一個(gè)重復(fù)測(cè)量的兩因素設(shè)計(jì)資料的方差分析，結(jié)果顯示兩組集落計(jì)數(shù)具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差別。 2．顯微鏡觀察：新鮮AML BM MNC與液氮凍存AML BM MNC均在培養(yǎng)第2天開始出現(xiàn)集落，第7天集落數(shù)量最高；統(tǒng)計(jì)學(xué)方法與實(shí)驗(yàn)1相同，結(jié)果顯示二者在相同培養(yǎng)條件下形成集落計(jì)數(shù)無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差別。 第二部分：CFU-L為白血病干/祖細(xì)胞的集落，其細(xì)胞形態(tài)學(xué)類似小淋巴細(xì)胞，

8、無特異表現(xiàn)，不應(yīng)具有成熟血細(xì)胞或常見的白血病細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)收獲的集落細(xì)胞的形態(tài)學(xué)符合上述特點(diǎn)；CFU-L的細(xì)胞免疫分型的特點(diǎn)為CD34<'+>CD38<'->，其粒系分子表面標(biāo)志CD13<'+>CD15<'+>CD33<'+>的表達(dá)低，本實(shí)驗(yàn)收獲的集落細(xì)胞CD34<'+>CD38<'->的表達(dá)為16.94％±4.52％；CD13<'+>、CD15<'+>及CD3<'+>的表達(dá)分別為5.26％±1.92％、6.72％±1.03％

9、及6.77％±3.58％，符合CFU-L的特點(diǎn)。 第三部分：體外分化實(shí)驗(yàn)最終獲得的細(xì)胞，在含與不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)第20天時(shí)收獲細(xì)胞的平均計(jì)數(shù)分別為0.98×10<'6>個(gè)、90.67×10<'8>個(gè)，經(jīng)成對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，存在明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差別；收獲細(xì)胞沒有特殊染色顆粒等成熟粒細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，細(xì)胞免疫分型的鑒定結(jié)果：CD34<'+>CD38<'->、CD13<'+>、CD15<'+>及CD33<'+>表達(dá)分別為：0.3

10、0±0.17％、10.73±3.05％、9.67±2.59％及12.35±3.15％，均不符合成熟粒細(xì)胞的特點(diǎn)。 結(jié)論： 1、在CFU-L的培養(yǎng)條件下，正常人BM MNC不形成集落，可以排除HSC的污染；新鮮AML BM MNC與液氮凍存AML BM MNC形成集落的能力無明顯差別，可以用液氮凍存的AML BM MNC樣本做為實(shí)驗(yàn)樣本的補(bǔ)充。 2、經(jīng)IL-3、SCF、GM-CSF等細(xì)胞因子刺激的AML BM MN