Shh信號(hào)通路參與慢性粒細(xì)胞白血病干-祖細(xì)胞調(diào)控的研究.pdf

1、本文內(nèi)容主要分為四部分：
　　第一部分
　　Shh信號(hào)通路在慢性粒細(xì)胞白血病的表達(dá)及與疾病進(jìn)展的相關(guān)性
　　目的：本研究旨在探討 Shh信號(hào)通路關(guān)鍵組分在慢性粒細(xì)胞白血病患者和健康對(duì)照的骨髓單個(gè)核細(xì)胞的表達(dá)差異,以明確 Shh信號(hào)通路在慢性粒細(xì)胞白血病的活化狀態(tài)。在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步分析 Shh信號(hào)通路在慢性粒細(xì)胞白血病慢性期、加速期、急變期活化狀態(tài)的差異,以明確 Shh信號(hào)通路與慢性粒細(xì)胞白血病疾病進(jìn)展的相關(guān)性。

2、>　　方法：收集我院初診的慢性期、加速期、急變期的慢性粒細(xì)胞白血病患者及健康對(duì)照的骨髓標(biāo)本,分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞。用普通 PCR方法(RT-PCR)檢測(cè) Shh信號(hào)通路的關(guān)鍵組分 SHH、SMO、PTCH1、GLI1基因在慢性粒細(xì)胞白血病患者及健康對(duì)照的骨髓單個(gè)核細(xì)胞的表達(dá)差異,并采用更為敏感的Real time PCR(RQ-PCR)技術(shù)進(jìn)一步檢測(cè)慢性粒細(xì)胞白血病各期標(biāo)本之間及與健康對(duì)照之間的SHH、SMO、PTCH1、GLI1基因的表

3、達(dá)差異。
　　結(jié)果：Shh信號(hào)通路的每一個(gè)組分在同一期慢性粒細(xì)胞白血病患者不同個(gè)體之間存在著差異表達(dá),以慢性期最為顯著。大約50％的慢性期標(biāo)本,70％的加速期標(biāo)本和80％的急變期標(biāo)本骨髓單個(gè)核細(xì)胞 Shh信號(hào)通路的正向調(diào)控組分 SHH、SMO、GLI1基因的表達(dá)較正常健康對(duì)照升高2倍以上,表明慢性粒細(xì)胞白血病骨髓單個(gè)核細(xì)胞存在著Shh信號(hào)通路的活化。與慢性期相比,加速期和急變期的患者出現(xiàn) Shh信號(hào)通路活化的比例和程度明顯增高,表

4、明 Shh信號(hào)通路與慢性粒細(xì)胞白血病的疾病進(jìn)展正相關(guān)。
　　結(jié)論：慢性粒細(xì)胞白血病骨髓單個(gè)核細(xì)胞存在著 Shh信號(hào)通路的活化,Shh信號(hào)通路與慢性粒細(xì)胞白血病的疾病進(jìn)展相關(guān)。
　　第二部分
　　Shh信號(hào)通路在慢性粒細(xì)胞白血病干/祖細(xì)胞的表達(dá)
　　目的：本研究旨在探討 Shh信號(hào)通路的關(guān)鍵組分在慢性粒細(xì)胞白血病干/祖細(xì)胞的表達(dá),以明確 Shh信號(hào)通路在慢性粒細(xì)胞白血病干/祖細(xì)胞的活化狀態(tài)。
　　方法：收集我

5、院初診的慢性期、加速期、急變期的慢性粒細(xì)胞白血病骨髓標(biāo)本,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各期 CD34的陽性率。免疫熒光法檢測(cè) CD34/C-kit與 Shh蛋白在加速期和急變期骨髓涂片的共表達(dá)。陽性免疫磁珠分選法分離骨髓 CD34+細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)磁珠分選的效率。用實(shí)時(shí)定量 PCR方法檢測(cè) Shh信號(hào)通路的關(guān)鍵組分 SHH、SMO、PTCH1、GLI1在 CD34+細(xì)胞與 CD34-細(xì)胞的表達(dá)。用免疫熒光法檢測(cè) Shh蛋白在 CD34+細(xì)胞與 C

6、D34-細(xì)胞的表達(dá)。分離骨髓基質(zhì)細(xì)胞,免疫熒光法檢測(cè) Shh蛋白在骨髓基質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)。用普通 PCR的方法檢測(cè) Shh信號(hào)通路的關(guān)鍵組分 SHH、SMO、PTCH1、GLI1在慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系 K562的表達(dá),免疫熒光法檢測(cè) Shh蛋白在 K562細(xì)胞的表達(dá)。
　　結(jié)果：CML-CP、CML-AP、CML-BP標(biāo)本的CD34+細(xì)胞分別在0.2％～2.0％、4.0％～10.0％、12.5％～97.5％范圍內(nèi)。CD34和Shh蛋

7、白以及c-kit和Shh蛋白在加速期和急變期的骨髓涂片中呈現(xiàn)一致性表達(dá),即高表達(dá) CD34或 c-kit的細(xì)胞同時(shí)高表達(dá) Shh蛋白,而低表達(dá) CD34或 c-kit的細(xì)胞同時(shí)低表達(dá) Shh蛋白。磁珠分選的CD34+細(xì)胞的在95％以上。純化的CD34+細(xì)胞與 CD34-細(xì)胞相比,高表達(dá) Shh信號(hào)通路的正向調(diào)控組分 SHH、SMO、GLI1,而低表達(dá) Shh信號(hào)通路的負(fù)向調(diào)控組分 PTCH1。CD34+和CD34-細(xì)胞內(nèi)也可見 CD34

8、與 Shh蛋白的一致性表達(dá)。慢性粒細(xì)胞白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞低表達(dá) Shh蛋白。K562細(xì)胞表達(dá) Shh信號(hào)通路的關(guān)鍵組分,Shh蛋白在 K562細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)差異表達(dá):部分細(xì)胞高表達(dá) Shh蛋白,其余細(xì)胞低表達(dá) Shh蛋白。
　　結(jié)論：慢性粒細(xì)胞白血病干/祖細(xì)胞內(nèi)存在著 Shh信號(hào)通路的活化,自我分泌的Shh蛋白介導(dǎo)了慢性粒細(xì)胞白血病干/祖細(xì)胞內(nèi) Shh信號(hào)通路的自我激活。
　　第三部分
　　Shh信號(hào)通路對(duì)慢性粒細(xì)胞白血病

9、干/祖細(xì)胞功能的影響
　　目的：本研究旨在探討 Shh信號(hào)通路對(duì)慢性粒細(xì)胞白血病干/祖細(xì)胞生存和增殖的影響。
　　方法：磁珠分選性慢粒細(xì)胞白血病加速期、急變期的骨髓 CD34+和CD34-的細(xì)胞,純化的CD34+和CD34-的細(xì)胞于10ng/ml IL-3、10ng/ml IL-6、50ng/ml SCF培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。CD34+和CD34-的細(xì)胞均分別用外源性 Shh肽和Shh通路的抑制劑cyclopamine作用72h,

10、MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖。K562細(xì)胞進(jìn)行以下分組⑴對(duì)照組⑵Shh組(500ng/ml)⑶ cyclopamine組(10μM)⑷ Shh(500ng/ml)+cyclopamine(10μM)組,24、48h后收獲細(xì)胞,MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖。Shh信號(hào)通路的抑制劑5E1單克隆抗體(4、6、8、10、20、30μg/ml)和cyclopamine(10、20、40μM)分別作用于 K562細(xì)胞,24h后采用普通光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞數(shù)目的變化,

11、 Annexin V/PI法檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率,PI法檢測(cè)細(xì)胞周期。體外化學(xué)合成針對(duì) GLI1的小干擾 RNA(siRNA),通過脂質(zhì)體(Lipofectamine2000)介導(dǎo)將其導(dǎo)入 K562細(xì)胞,并以非特異性的siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為對(duì)照。設(shè)置 siRNA濃度梯度(40、60、80、100、200 pmol),檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率,探索最佳轉(zhuǎn)染濃度。實(shí)時(shí)定量 PCR和western blot法檢測(cè) siRNA的沉默效應(yīng)。MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后2

12、4、48h細(xì)胞的增殖能力。
　　結(jié)果：純化的CD34-細(xì)胞在外源性 Shh肽的作用下,經(jīng)過72h細(xì)胞擴(kuò)增了1.18±0.04倍,純化的CD34+細(xì)胞擴(kuò)增了1.64±0.11倍,CD34+細(xì)胞的擴(kuò)增幅度明顯高于 CD34-細(xì)胞(P<0.01)。純化的CD34-細(xì)胞在外源性 cyclopamine作用下,經(jīng)過72h,細(xì)胞數(shù)目為最初的0.75±0.03倍,而CD34+細(xì)胞為最初的0.88±0.04倍,CD34+細(xì)胞的凋亡幅度明顯低于 C

13、D34-細(xì)胞(P<0.01)。經(jīng)過24h,對(duì)照組的K562細(xì)胞數(shù)目是最初的1.57±0.09倍,Shh組是最初的1.63±0.10倍(與對(duì)照組相比,P=0.13),cyclopamine組是最初的1.05±0.08倍(P<0.01),Shh+cyclopamine組是最初的1.17±0.09倍(P<0.01),經(jīng)過48h,對(duì)照組的K562細(xì)胞數(shù)目是最初的1.32±0.08倍,Shh組是最初的1.78±0.07倍(與對(duì)照組相比,P<0.0

14、1),cyclopamine組是最初的0.64±0.07倍(P<0.01), Shh+cyclopamine組是最初的0.72±0.10倍(P<0.01)。表明外源性 Shh肽促進(jìn)了K562細(xì)胞的增殖,而cyclopamine誘導(dǎo)了K562細(xì)胞凋亡,并呈現(xiàn)時(shí)間依賴性。5E1單克隆抗體和cyclopameine以劑量依賴的方式誘導(dǎo)了K562細(xì)胞的凋亡,并誘導(dǎo)了K562細(xì)胞 G2/M期阻滯。轉(zhuǎn)染后24h,實(shí)驗(yàn)組 GLI1mRNA表達(dá)水平為對(duì)

15、照組的(52.60±3.57)％(P<0.01),48h為對(duì)照組的(88.83±5.21)％( P=0.01),72h為對(duì)照組的1.36±0.11倍(P<0.01)。轉(zhuǎn)染后24h實(shí)驗(yàn)組 Gli1的蛋白表達(dá)水平為對(duì)照組的(88.60±6.13)％(P=0.02),48h為對(duì)照組的(79.31±5.58)％(P<0.01)。轉(zhuǎn)染后24h實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)目為對(duì)照組的(94.41±3.58)％( P=0.05),48h為對(duì)照組(90.22±3.34

16、)％( P<0.01),表明 GLI1 siRNA抑制了GLI1的表達(dá),并誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)論：自我激活的Shh信號(hào)通路維持了慢性粒細(xì)胞白血病干/祖細(xì)胞的生存,并促進(jìn)了其增殖,靶向抑制Shh信號(hào)通路可以導(dǎo)致慢性粒細(xì)胞白血病干/祖細(xì)胞的凋亡和細(xì)胞周期阻滯。
　　第四部分
　　Shh信號(hào)通路調(diào)控慢性粒細(xì)胞白血病干/祖細(xì)胞的機(jī)制
　　目的：本研究旨在通過研究慢性粒細(xì)胞白血病干/祖細(xì)胞內(nèi) Shh信號(hào)通路與 Wnt信

17、號(hào)通路的關(guān)系及相互作用以明確 Shh信號(hào)通路調(diào)控 CML干/祖細(xì)胞的機(jī)制。
　　方法：磁珠分選慢性粒細(xì)胞白血病加速期、急變期的骨髓標(biāo)本的CD34+和CD34-的細(xì)胞。免疫熒光法檢測(cè) Shh蛋白和β-catenin蛋白在 CD34+和CD34-的細(xì)胞表達(dá)。分離骨髓基質(zhì)細(xì)胞,免疫熒光法檢測(cè) Shh蛋白和β-catenin蛋白在骨髓基質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)。RT-PCR檢測(cè) Shh信號(hào)通路的關(guān)鍵組分和Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵組分在 K562細(xì)胞的表達(dá)

18、,免疫熒光法檢測(cè) Shh蛋白和β-catenin蛋白的表達(dá)。將 K562細(xì)胞進(jìn)行如下分組(1)對(duì)照組(2)Shh抗體組(10μg/ml)(3)Shh抗體(10μg/ml)+ Wnt3a(500ng/ml)組(4)Wnt3a抗體(10μg/ml)(5)Wnt3a抗體(10μg/ml)+ Shh-N(500ng/ml)組, Annexin V/PI檢測(cè)各組的凋亡率。RT-PCR檢測(cè) K562細(xì)胞在10μg/ml Shh抗體作用24h后 GL

19、I1、β-CATENIN、C-MYC的表達(dá)變化。Real time PCR檢測(cè) K562細(xì)胞分別在10μg/ml Shh抗體作用24h后 GLI1、β-CATENIN、C-MYC、、P21、BCL-2的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：CD34+及CD34-的細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞、K562細(xì)胞內(nèi)均呈現(xiàn) Shh蛋白和β-catenin蛋白的共表達(dá)。K562細(xì)胞表達(dá) Shh信號(hào)通路和Wnt信號(hào)通路關(guān)鍵組分。K562細(xì)胞對(duì)照組24h后的凋亡率是4.1

20、5±1.02％,Shh抗體組(10μg/ml)的凋亡率是15.88±2.87％,Shh抗體(10μg/ml)+ Wnt3a(500ng/ml)組的凋亡率是8.41±1.38％(與Shh抗體組相比 P<0.01), Wnt3a抗體(10μg/ml)的凋亡率是17.34±3.15％,Wnt3a抗體(10μg/ml)+ Shh-N(500ng/ml)組凋亡率是14.89±2.79％(與 Wnt3a抗體組相比, P=0.60)。即 Wnt3a能

21、部分逆轉(zhuǎn) Shh抗體誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,而Shh-N不能逆轉(zhuǎn) Wnt3a抗體誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,表明 Wnt信號(hào)通路位于 Shh信號(hào)通路的下游。K562細(xì)胞在10μg/ml Shh抗體作用24 h后 GLI1的表達(dá)下降了7.92±0.89倍,β-CATENIN的表達(dá)下降了0.21±0.14倍,C-MYC的表達(dá)下降了4.95±0.57倍,P21的表達(dá)上調(diào)了11.57±1.23倍,BCL-2的表達(dá)下調(diào)了2.55±0.21倍。GLI1、C-MYC、B