吖啶酮類化合物LZY13逆轉人白血病K562-ADM細胞多藥耐藥作用及機制研究.pdf

1、目的：篩選新型吖啶酮類化合物 LZY13作為逆轉劑，研究其對腫瘤細胞多藥耐藥性的體外逆轉作用，并探討其可能的逆轉作用機制。
　　方法：以人白血病K562細胞和耐阿霉素人白血病K562/ADM細胞為研究對象，應用MTT法檢測LZY13和阿霉素（ADM）對細胞增殖的抑制作用，測定K562/ADM細胞對ADM的耐藥倍數；應用MTT法篩選出LZY13對K562和K562/ADM細胞的無毒劑量，檢測其對多藥耐藥腫瘤細胞耐藥性的體外逆轉作用；

2、應用高內涵活細胞成像系統(tǒng)檢測LZY13對K562和K562/ADM細胞內ADM和羅丹明123（Rh123）蓄積的影響；應用MTT法檢測LZY13聯用抑制劑后對K562/ADM細胞增殖的影響，并進一步觀察LZY13發(fā)揮逆轉作用可能的信號通路；應用流式細胞術分析LZY13對ADM誘導K562/ADM細胞凋亡、自噬和活性氧（ROS）產生的影響；應用Western Blot方法檢測LZY13對人白血病耐藥細胞K562/ADM中P-gp以及抑癌基

3、因p53等相關蛋白表達的影響。
　　結果：MTT檢測結果顯示，ADM對K562和K562/ADM細胞的IC50值分別為（1.06±0.12） mg/L和（74.15±6.52）mg/L，K562/ADM細胞對ADM的耐藥倍數為70倍。MTT結果表明，當LZY13的濃度在1μmol/L及其以下劑量時，其對兩種細胞的抑制率均小于10％，對細胞增殖無明顯影響。因此，1μmol/L及其以下濃度為LZY13的無毒劑量。MTT法檢測顯示，LZ

4、Y13在無毒劑量（0.1~1μmol/L）下能夠劑量依賴性地降低ADM對耐藥細胞 K562/ADM的 IC50值，在體外成功逆轉了人白血病耐藥細胞K562/ADM對ADM的耐受性，且其逆轉倍數呈劑量依賴性地增加。同等濃度（1μmol/L）下，LZY13的逆轉作用比陽性對照藥維拉帕米（Verapamil）強59.88倍，逆轉效果明顯優(yōu)于后者。阿霉素蓄積實驗和羅丹明蓄積實驗結果表明，LZY13可劑量依賴性地增加多藥耐藥細胞K562/ADM細

5、胞內ADM、Rh123的蓄積量。流式細胞術和MTT結果顯示，LZY13（0.5?M）與ADM（10 mg/L）聯用以后，人白血病耐藥細胞 K562/ADM的凋亡細胞數量顯著增加，用 caspase家族抑制劑Z-VAD-FMK處理細胞后，LZY13與ADM聯用組的細胞凋亡率和細胞抑制率均明顯下降。MDC染色和MTT法檢測結果表明，LZY13可促進ADM誘導K562/ADM細胞發(fā)生自噬，LZY13與ADM聯用后，MDC染色熒光強度增強，K5

6、62/ADM細胞自噬比率明顯增加，相應地其細胞抑制率也明顯升高；加入3-MA后，LZY13與ADM聯用組的細胞自噬比率及細胞抑制率均顯著降低。細胞內ROS水平檢測結果顯示，LZY13與ADM聯用后，DCF染色陽性細胞明顯增多即細胞內 ROS含量顯著增加，同時其細胞生長抑制率亦明顯升高；加入抗氧化劑Catalase處理細胞后，K562/ADM細胞內ROS含量及其細胞抑制率均顯著下降。通過Western Blot分析可知，耐藥細胞K562/

7、ADM中P-gp蛋白呈高表達，經LZY13與ADM聯用處理后的細胞，P-gp蛋白的表達顯著下降；另外，LZY13與ADM聯用后，抑癌基因p53的表達增多，加入Pifithrin-α處理細胞后，p53的表達明顯下降。
　　結論：吖啶酮類化合物LZY13在體外可有效逆轉人白血病耐藥細胞K562/ADM對ADM的耐受性，能夠有效恢復腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。LZY13逆轉腫瘤細胞多藥耐藥的作用機制可能是與抑制 P-gp蛋白的藥物外排功