慢病毒介導的RNA干擾逆轉單因素耐藥細胞系K562-MDR1耐藥性的研究.pdf

1、研究背景: 耐藥是化療失敗的一個主要原因。耐藥產生的原因是多因素的，其中MDR1基因編碼的P-gp蛋白最具代表性。在逆轉MDR1基因的體外研究中通常采用的是藥物誘導產生的耐藥細胞系，其耐藥為多種因素所致，且耐藥性的維持不夠穩(wěn)定。 逆轉MDR1基因及其產物所致耐藥的途徑有多種，但從理論上講，在基因水平逆轉MDR1基因才是解決問題的關鍵。而近來發(fā)展起來的RNA干擾技術，為MDR1基因的逆轉提供了一種新的高效特異的方法。

2、 慢病毒載體是一種很有前途的基因轉移載體，可感染非分裂細胞，目的基因整合至靶細胞基因組而長期表達。通過慢病毒載體介導的RNA干擾，使長效抑制目的基因表達成為可能。 研究目的: 1．構建MDR1基因單因素所致耐藥細胞模型K562/MDR1。 2．構建編碼靶向MDRl基因shRNA的慢病毒載體。 3．研究慢病毒介導的RNA干擾對MDR1基因所致耐藥性的逆轉情況。 研究方法: 1．構建MDR1

3、基因單因素耐藥細胞系K562/MDR1：包裝具MDR1基因全長cDNA的逆轉錄病毒，感染對化療藥物敏感的白血病細胞系K562，用秋水仙堿篩選耐藥細胞，經無限稀釋法克隆，得到單克隆的單因素耐藥細胞系K562/MDR1。熒光定量PCR檢測K562/MDR1的MDR1基因，流式細胞儀檢測其P-gp蛋白表達，柔紅霉素泵出實驗檢測P-gp蛋白功能，MTT試驗檢測其對化療藥物的敏感性。 2．慢病毒介導的RNA干擾逆轉MDR1基因所致耐藥性：

4、構建編碼靶向MDR1基因shRNA的慢病毒載體并測序，包裝慢病毒，感染耐藥細胞系K562/MDRl和K562/A02，從以下四方面研究RNA干擾后其耐藥性的變化：熒光定量PCR檢測MDRl基因在mRNA水平的變化，流式細胞儀檢測P-gp蛋白表達水平的變化，柔紅霉素泵出實驗檢測細胞藥物外排能力的變化，MTT試驗檢測細胞耐藥性的變化。 研究結果: 1．成功構建MDR1基因單因素耐藥細胞系K562/MDR1：熒光定量PCR示M

5、DR1基因相對定量值為2.79x10<'3>，遠高于K562細胞；流式細胞儀檢測細胞表面P-gp蛋白表達高達96.10％；柔紅霉素泵出率為90.93％，顯示了強大的藥物外排能力；MTT結果示細胞明顯對化療藥物耐藥。 2．成功構建編碼靶向MDR1基因shRNA的慢病毒載體：合成編碼shRNA的DNA序列亞克隆到慢病毒載體plentilox 3.7，測序結果示插入正確。 3．慢病毒介導的RNA干擾能有效逆轉MDR1基因所致耐

6、藥性：慢病毒顯示出對耐藥細胞高效、穩(wěn)定的感染能力，有利于后續(xù)的RNA干擾實驗。熒光定量PCR結果示RNA干擾后兩種耐藥細胞的MDRl基因水平均明顯下調(K562/MDR1下調達100％，K562/A02下調達96.15％)； 流式細胞儀檢測到細胞表面P-gp蛋白表達也明顯下調(兩種細胞均達100％)；柔紅霉素泵出試驗證實干擾后耐藥細胞藥物外排能力的明顯下降；MTT試驗示RNA干擾后耐藥細胞耐藥性明顯下降。各項指標均證實慢病毒介導

7、的RNA干擾有效逆轉了MDR1基因所致耐藥性。 結論: 1．采用逆轉錄病毒載體介導的轉基因方法成功構建了MDR1基因單因素所致耐藥細胞系K562/MDR1，為研究MDR1基因介導的耐藥提供了更穩(wěn)定，更特異的細胞模型。 2．我們構建的編碼靶向MDR1基因shRNA的慢病毒載體，可有效下調MDR1基因和P-gp蛋白表達，逆轉MDR1基因介導的耐藥，但基因下調與蛋白下調存在時間上的不同步。 3．慢病毒介導RNA