慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾對(duì)人非小細(xì)胞肺癌化療多藥耐藥性的研究.pdf

1、目的研究與腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性（MDR）相關(guān)的兩個(gè)基因MDR1、MRP 對(duì)非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）的多藥耐藥性的關(guān)系。采用RNA 干擾技術(shù)（RNAi），構(gòu)建表達(dá)Si-MDR1和Si-MRP的重組慢病毒PTM-Si-MDR1、PTM-Si-MRP，轉(zhuǎn)染人肺癌細(xì)胞A549及其耐順鉑細(xì)胞株A549/DDP，研究化療藥物對(duì)RANi后細(xì)胞的殺傷效果，探討治療NSCLC的新方法。研究共分三部分：第一部分MDR1、MRP基因SiRNA 有效位點(diǎn)的篩選

2、；第二部分Si-MDR1、Si-MRP 重組慢病毒載體的構(gòu)建；第三部分Si-MDR1，Si-MRP 逆轉(zhuǎn)A549/DDP 細(xì)胞耐藥性的體外及體內(nèi)研究。
　　 方法（1）MDR1、MRP基因各設(shè)計(jì)四個(gè)干擾位點(diǎn)，合成SiRNA片段,分別連接質(zhì)粒載體pSUPER 并轉(zhuǎn)染人肺癌細(xì)胞A549。48小時(shí)后，熒光顯微鏡觀察重組質(zhì)粒對(duì)A549 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，熒光定量PCR 檢測(cè)MDR1、MRP 在mRNA 水平上的表達(dá)，篩選出有效干擾位點(diǎn)用于

3、慢病毒包裝。（2）采用PTM、pHelper1.0、pHelper0 慢病毒載體系統(tǒng)介導(dǎo)Si-MDR1、Si-MRP的表達(dá)。轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞得到大量重組慢病毒，轉(zhuǎn)染Hela 細(xì)胞進(jìn)行病毒滴度測(cè)定。重組慢病毒轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞A549、A549/DDP兩天后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率、熒光定量PCR和Western Blot 檢測(cè)MDR1、MRP 在mRNA水平和蛋白水平上的干擾效率。（3）三種化療藥物順鉑（DDP）、阿霉素（ADM）、健擇（G

4、emzer）分別作用A549-Si-MDR1及A549/DDP-Si-MDR1 細(xì)胞24小時(shí)后，熒光顯微鏡觀察EGFP 陽(yáng)性細(xì)胞形態(tài)變化。（4）PTM、PTM-Si-MDR1、PTM-Si-MRP在體外分別感染A549及A549DDP 細(xì)胞（MOI=10）1周后，加入不同濃度的化療藥物：Gemzer、ADM、DDP，作用48小時(shí)后CCK-8 試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。（5）建立PTM、PTM-Si-MDR1、PTM-Si-MR 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的

5、A549及A549/DDP 細(xì)胞株，在BALB/c 裸鼠體內(nèi)建立原位肺癌異種移植模型，給予藥物后觀察動(dòng)物體重、腫瘤生長(zhǎng)及多處轉(zhuǎn)移情況，全面評(píng)價(jià)MDR表型。
　　 結(jié)果（1）成功設(shè)計(jì)MDR1、MRP基因的SiRNA 干擾片段，并構(gòu)建MDR1、MRPSiRNA 篩選質(zhì)粒，pSUPER-Si-MDR1、pSUPER-Si-MRP 篩選有效干擾位點(diǎn)。（2）成功將構(gòu)建的篩選質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到人肺癌細(xì)胞A549及其耐順鉑細(xì)胞株A549/DDP中，轉(zhuǎn)

6、染48小時(shí)后，熒光顯微鏡檢測(cè)綠色熒光蛋白確定轉(zhuǎn)染效率約47.9％。（3）采用熒光定量PCR 檢測(cè)轉(zhuǎn)染48小時(shí)后A549 細(xì)胞中MDR1、MRP 在mRNA 水平上的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，MDR1、MRP基因得到特異高效的沉默，證明pSUPER-Si-MDR1,pSUPER-Si-MRP 質(zhì)粒構(gòu)建成功，是有效的SiRNA表達(dá)質(zhì)粒。（4）篩選出的有效干擾位點(diǎn)序列用于慢病毒包裝。轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，結(jié)

7、果證明包裝好的慢病毒載體能高效轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率85％，并能穩(wěn)定表達(dá)SiRNA。（5）重組慢病毒轉(zhuǎn)染Hela 細(xì)胞進(jìn)行滴度測(cè)定，為5×108TU/ml。（6）PTM-Si-MDR1、PTM-Si-MRP 均以MOI=10 轉(zhuǎn)染A549兩天后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，PTM-Si-MDR1 轉(zhuǎn)染效率為77.3％，PTM-Si-MRP 轉(zhuǎn)染效率80.8％。（7）Real-time PCR、Western Blot 檢測(cè)轉(zhuǎn)染兩天的A

8、549 細(xì)胞MDR1、MRP 在mRNA 水平和蛋白水平上的表達(dá)，計(jì)算MDR1 抑制效率為72％，MRP 抑制效率為69％，抑制效果明顯。（8）化療藥物DDP（50ug/ml）、ADM（1ug/ml）、Gemzer（200ug/ml）作用于A549-Si-MDR1 細(xì)胞（轉(zhuǎn)染一周）24小時(shí)后，明場(chǎng)及熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞皺縮，形態(tài)發(fā)生變化，出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象。（9）不同濃度的DDP、ADM、Gemzer分別作用于RNAi后的細(xì)胞A

9、549(A549-PTM、A549-PTM-Si-MRP、A549-PTM-Si-MDR1）和A549/DDP（A549/DDP-PTM、A549/DDP-PTM-Si-MRP、A549/DDP-PTM-Si-MDR1）,48小時(shí)后CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性，結(jié)果顯示RNAi后，A549/DDP 細(xì)胞中，三組藥物的Si-MRP、Si-MDR 干擾組和對(duì)照組相比較，其敏感性有明顯提高；A549 細(xì)胞中MRP、MDR 干擾組和對(duì)照組對(duì)藥物的敏

10、感性無(wú)明顯差異。（10）在肺癌原位異種移植裸鼠模型體內(nèi)，與PTM 空載體轉(zhuǎn)染的A549/DDP 耐藥株相比，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PTM-Si-MDR1、PTM-Si-MRP 至A549/DDP 耐藥株，可顯著降低原發(fā)腫瘤大小及對(duì)側(cè)肺轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處皮下轉(zhuǎn)移率，完全逆轉(zhuǎn)其MDR表型。
　　 結(jié)論我們首次把慢病毒介導(dǎo)的RNAi 技術(shù)用于人肺癌中多藥耐藥性基因的研究，并證明它能持久抑制人肺癌細(xì)胞A549及其耐順鉑細(xì)胞株A549/DDP中的MDR1、MR