金屬硫蛋白IH在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其對(duì)耐藥性的影響.pdf

1、金屬硫蛋白(metallothionein，MT)是一類普遍存在的低分子量(6-7KD)，富含半胱氨酸的金屬結(jié)合蛋白。MT對(duì)維持一些必需金屬的體內(nèi)代謝平衡及抵抗有毒金屬毒性、清除自由基有重要意義。近年來(lái)，MT和腫瘤的關(guān)系成為研究的熱點(diǎn)。MT參與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、分化以及化療耐藥，影響治療和預(yù)后。人類MT基因位于染色體16q13，包括10個(gè)功能性基因：MT2A、MT1A、MT1B、MT1E、MT1F、MT1G、MT1H、MT1X、MT3

2、和MT4。研究表明，不同金屬硫蛋白異構(gòu)體在人發(fā)育或在不同生理?xiàng)l件下可能功能不同。各種MT異構(gòu)體有獨(dú)特的功能。目前，各個(gè)異構(gòu)體的功能尚不清楚，研究比較多的是MT2A異構(gòu)體，對(duì)于MT1H資料甚少。 因此，本課題我們首先利用半定量RT-PCR方法、免疫組化方法分別檢測(cè)了68例NSCLC組織及25例良性肺組織中MT1H mRNA和IMT蛋白表達(dá)水平，探討其在NSCLC發(fā)病中的作用和臨床意義；然后研究外源性MT1H基因?qū)Ψ蜗侔┘?xì)胞株A54

3、9生物學(xué)行為及化療敏感性的影響，并應(yīng)用siRNA干擾A549順鉑耐藥株A549/DDW中MT1H的表達(dá)，反證MT1H在肺癌耐藥中的作用；并進(jìn)一步分析46例NSCLC患者化療前后外周血MT1H表達(dá)情況和順鉑耐藥性的關(guān)系。通過(guò)對(duì)肺癌細(xì)胞系和臨床標(biāo)本的研究，不但為NSCLC的發(fā)生、發(fā)展提供理論依據(jù)，而且為NSCLC患者化療藥物耐藥性尋找新的靶點(diǎn)提供了理論依據(jù)。 本實(shí)驗(yàn)分為以下四部分： 第一部分MT1H在人非小細(xì)胞肺癌及肺腺癌細(xì)

4、胞株中的表達(dá)方法： 1．采用半定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)68例NSCLC組織及25例良性肺病變組織、肺腺癌A549細(xì)胞株及其順鉑耐藥株A549/DDP中MT1H mRNA的表達(dá)。 2．采用免疫組化技術(shù)對(duì)68例NSCLC組織及25例良性肺病變組織中MT蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。 3．統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：利用SPSS10.0軟件處理數(shù)據(jù)，結(jié)果用陽(yáng)性率表示，采用x<'2>檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson's相關(guān)分析。以α=0.05為

5、顯著性。 結(jié)果： 1．68例NSCLC組織中28例MT1H mRNA表達(dá)陽(yáng)性，陽(yáng)性表達(dá)率為41.2％，25例良性肺病變組織均不表達(dá)。 2．68例NSCLC組織中47例MT蛋白表達(dá)陽(yáng)性，25例良性肺病變組織中7例表達(dá)陽(yáng)性。陽(yáng)性表達(dá)率分別為69.1％、28.0％。兩者對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 3．MT1H mRNA在高中分化NSCLC中表達(dá)陽(yáng)性率為25.9％，在低分化NSCLC中陽(yáng)性率為51.2

6、％，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而且，腫瘤分化程度越低，陽(yáng)性率越高。MT1H mRNA表達(dá)與性別、年齡、組織學(xué)類型、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否均無(wú)關(guān)(P>0.05)。 4．MT蛋白在高中分化NSCLC中表達(dá)陽(yáng)性率為44.4％，在低分化NSCLC中陽(yáng)性率為85.4％，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而且，腫瘤分化程度越低，陽(yáng)性率越高。此外，在<60歲的患者中陽(yáng)性率為57.9％，而在>60歲的患者中陽(yáng)性率為8

7、3.3％，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。MT1H蛋白表達(dá)與性別、組織學(xué)類型、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否均無(wú)關(guān)(P>0.05)。 5．在MT蛋白表達(dá)陽(yáng)性的47例標(biāo)本中，MT1H mRNA陽(yáng)性表達(dá)28例，陰性表達(dá)19例；在MT蛋白表達(dá)陰性的21例標(biāo)本中，MT1H mRNA也全呈陰性表達(dá)；經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩者呈正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。 6．MT1H mRNA在A549/DDP細(xì)胞株中高表達(dá)而在A549細(xì)胞中不表達(dá)

8、。 第二部分MT1H基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)及其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞周期和順鉑耐藥性的影響 第一章 MT1H基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在A549細(xì)胞中的表達(dá)方法： 1．用PCR法從含MT1H基因的質(zhì)粒pACT2-MT1H中獲得目的基因cDNA片段，正向插入真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1/myc-his(-)中，構(gòu)建MT1H重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-MT1H。 2．把pcDNA3-1(-)-MT1H以

9、脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染不表達(dá)MT1H的A549細(xì)胞，同時(shí)轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3.1(-)作為對(duì)照。經(jīng)G418篩選，獲得陽(yáng)性單克隆細(xì)胞。 3．采用半定量RT-PCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后A549細(xì)胞MT1HmRNA和蛋白的表達(dá)。 第二章 MT1H基因?qū)549細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞周期的影響方法： 1．采用MTT方法檢測(cè)MT1H轉(zhuǎn)染對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響。 2．采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MT1H轉(zhuǎn)染對(duì)A549細(xì)

10、胞周期的影響。 3．采用RT-PCR方法檢測(cè)MT1H轉(zhuǎn)染對(duì)A549細(xì)胞周期蛋白CyclinD1的影響。 4．統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：結(jié)果用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件包，兩組均數(shù)的比較用t檢驗(yàn)，多組均數(shù)的比較用方差分析(ANVOA)，以α=0.05為顯著性。 第三章 MT1H基因?qū)549細(xì)胞耐藥性的影響方法： 1．采用MTT方法檢測(cè)未轉(zhuǎn)染組、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和MT1H轉(zhuǎn)染組細(xì)胞對(duì)順鉑(DDP

11、)的藥物敏感性，并計(jì)算細(xì)胞對(duì)DDP的IC<,50>值。 2．上述3組細(xì)胞分別與5μg/ml和10μg/ml順鉑共同孵育24 h，用AnnexinV-FITC和PI雙染，然后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。 3．統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件包，兩組均數(shù)的比較用t檢驗(yàn)，多組均數(shù)的比較用方差分析(ANVOA)，以α=0.05為顯著性。 第三部分siRNA干擾MT1H基因?qū)5

12、49/DDP細(xì)胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)方法： 1．將終濃度為10 nM的MT1H siRNA轉(zhuǎn)染到耐順鉑A549細(xì)胞(A549/DDP)中同時(shí)轉(zhuǎn)染非特異siRNA作為對(duì)照組。 2．RT-PCR和Dot blot、免疫組化法檢測(cè)轉(zhuǎn)染48 h后MT1H mRNA和MT蛋白的表達(dá)水平。 3．MTT法檢測(cè)不同濃度DDP對(duì)MT1H siRNA轉(zhuǎn)染組和非特異siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞作用24 h后細(xì)胞的存活率，并計(jì)算細(xì)胞對(duì)DDP的IC<,5

13、0>值。 4．未轉(zhuǎn)染組、非特異siRNA轉(zhuǎn)染組和MTlH siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞聯(lián)合化療藥物DDP作用24 h后，用Annexin V-FITC和PI將細(xì)胞雙染，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。 5．未轉(zhuǎn)染組、非特異siRNA轉(zhuǎn)染組和MT1H siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞聯(lián)合化療藥物DDP作用24 h后，采用TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。 6．免疫組化方法檢測(cè)MT1H siRNA轉(zhuǎn)染前后Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)情況。

14、 7．統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件包兩組均數(shù)的比較用t檢驗(yàn)，多組均數(shù)的比較用方差分析。 第四部分非小細(xì)胞肺癌患者外周血中MT1H mRNA的表達(dá)與順鉑耐藥性的關(guān)系方法： 1．46例非小細(xì)胞肺癌初治患者，用含順鉑方案化療兩周期后評(píng)價(jià)療效，收集化療前后外周血，采用RT-PCR方法檢測(cè)MT1H mRNA表達(dá)情況，并探討其和近期化療療效的關(guān)系。 2．統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：結(jié)果用均數(shù)±

15、標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件包，進(jìn)行t檢驗(yàn)，以α=0.05為顯著性。 結(jié)論 1．MT蛋白在非小細(xì)胞肺癌組織和肺良性病變組織中表達(dá)存在差異，并且在癌組織中表達(dá)與分化程度、年齡有關(guān)。MT1H mRNA在非小細(xì)胞肺癌組織和肺良性病變組織中表達(dá)存在差異，并且在癌組織中表達(dá)與分化程度有關(guān)。提示MT蛋白和MT1H可能參與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展。 2．MT1H能夠促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞A549增殖，可能和上調(diào)C

16、yclinD1，促使細(xì)胞進(jìn)入S期增多有關(guān)。 3．MT1H能促進(jìn)A549細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥，可能和抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。 4．siRNA干擾MT1H表達(dá)，能降低Bcl-2表達(dá)，增強(qiáng)順鉑對(duì)A549/DDP細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用，有效逆轉(zhuǎn)A549/DDP細(xì)胞耐藥，在未來(lái)可能發(fā)展成為非小細(xì)胞肺癌一種新的治療方法。 5．晚期非小細(xì)胞肺癌患者，化療前外周血中MT1H mRNA表達(dá)和順鉑化療療效無(wú)關(guān)，提示MT1H和順鉑的原發(fā)性耐藥無(wú)關(guān)?；?/p>