慢病毒介導(dǎo)BC047440基因沉默逆轉(zhuǎn)HepG2-ADM細(xì)胞化療耐藥性機(jī)制的初步研究.pdf

1、目的和意義：
　　 原發(fā)性肝癌是世界上最常見(jiàn)的消化道腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率在惡性腫瘤中均位居前列[1]。原發(fā)性肝癌對(duì)我國(guó)人群健康危害非常巨大，目前以手術(shù)切除為主的綜合治療的總體療效不佳，其5年生存率僅有5%左右。輔助化療療效不佳是主要治療困難之一，其主要是由于原發(fā)性肝癌的多藥耐藥(multiple drug resistance，MDR)所致[2]。研究表明，肝癌的發(fā)生、發(fā)展是涉及多基因、多因素、多步驟的一個(gè)過(guò)程，癌基因、細(xì)

2、胞周期調(diào)節(jié)基因、細(xì)胞凋亡基因等眾多基因的異常激活或異常失活是肝癌發(fā)生的分子基礎(chǔ)[3]，而其包括化療耐藥在內(nèi)的多種臨床生物學(xué)行為則是多種拮抗/促進(jìn)因子平衡紊亂的結(jié)果[4]。通過(guò)基因?qū)W操作在分子水平上干預(yù)發(fā)生紊亂的平衡可能是解決肝癌多藥耐藥的關(guān)鍵。
　　 在前期的研究中，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一條功能未知的基因BC047440[5]，其在肝癌組織中呈高表達(dá)，且與肝癌的惡性程度呈正相關(guān)[6]，本實(shí)驗(yàn)利用RNAi技術(shù)，采用慢病毒介導(dǎo)HepG2/A

3、DM細(xì)胞系BC047440基因沉默，建立BC047440 RNA干擾模型，觀察沉默BC047440基因后對(duì)HepG2/ADM細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，并進(jìn)一步檢測(cè)BC047440沉默后相關(guān)基因在蛋白及mRNA水平的變化，初步探討慢病毒介導(dǎo)shRNA沉默BC047440基因逆轉(zhuǎn)HepG2/ADM化療耐藥性的作用機(jī)制，為進(jìn)一步的肝癌基因治療打下基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1.以適當(dāng)?shù)味鹊穆《绢w粒BC047440-shRNA及C

4、ontrol-shRNA感染HepG2/ADM細(xì)胞，培養(yǎng)48、72 h后在普通光鏡及對(duì)應(yīng)熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞中綠色熒光表達(dá)，選擇細(xì)胞狀態(tài)較好、綠色熒光表達(dá)率較高、強(qiáng)度較強(qiáng)的MOI值作為最適MOI值，并以此建立BC047440 RNA干擾模型。
　　 2.實(shí)驗(yàn)分為BC047440-shRNA組、control-shRNA組及HepG2/ADM組，其中BC047440-shRNA組、control-shRNA組分別加入對(duì)應(yīng)重組慢病毒

5、及對(duì)照空白慢病毒，HepG2/ADM組只加培養(yǎng)基，培養(yǎng)96h后提取各組HepG2/ADM細(xì)胞總蛋白行WesternBlotting檢測(cè)BC047440蛋白變化。
　　 3.實(shí)驗(yàn)分組同方法2，以阿霉素終末濃度2.5ug/ml培養(yǎng)各組細(xì)胞。分別于培養(yǎng)后24h、48h、72h采用CCK-8于酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定波長(zhǎng)460nm的吸光度值[D(460)]，計(jì)算其生長(zhǎng)抑制率。
　　 4.實(shí)驗(yàn)分組同方法2，取各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，培養(yǎng)48

6、h后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)、分析細(xì)胞周期分布的變化。各組細(xì)胞以終末濃度為0.04ug/ml的阿霉素作用48h后，于流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。
　　 5.實(shí)驗(yàn)分組同方法2，培養(yǎng)96h后提取各組細(xì)胞總蛋白及總RNA，Western Blotting檢測(cè)各組NF-κB蛋白表達(dá)變化，Real time PCR檢測(cè)各組細(xì)胞Survivin、CCNL1基因mRNA表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.成功建立BC047440 RN

7、A干擾模型；Western Blotting檢測(cè)提示培養(yǎng)96h后BC047440-shRNA組BC047440蛋白的相對(duì)表達(dá)量(0.353±0.009)較control-shRNA組(1.159±0.042)及HepG2/ADM組(1.205±0.019)降低，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，control-shRNA組與HepG2/ADM組BC047440蛋白相對(duì)表達(dá)量的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；BC047440-shR

8、NA組BC047440蛋白抑制率為71.5%。
　　 2.培養(yǎng)24h、48h后阿霉素對(duì)BC047440-shRNA組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用(生長(zhǎng)抑制率24h為0.593±0.317、48h為0.846±0.017)較control-shRNA組(生長(zhǎng)抑制率24h為0.355±0.027、48h為0.527±0.029)及HepG2/ADM組(生長(zhǎng)抑制率24h為0.341±0.027、48h為0.518±0.025)增強(qiáng)，其差異具有統(tǒng)計(jì)

9、學(xué)意義(P<0.05)；培養(yǎng)72h后阿霉素對(duì)各組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 3.流式細(xì)胞技術(shù)結(jié)果顯示BC047440-shRNA組細(xì)胞凋亡高于control-shRNA組及HepG2/ADM組，細(xì)胞周期多阻滯于S期，而control-shRNA組與HepG2/ADM組細(xì)胞周期則主要阻滯于G0/G1期。
　　 4.Western Blotting檢測(cè)NF-κB蛋白的相對(duì)表達(dá)量，以β-actin

10、為參照，提示培養(yǎng)96h后BC047440-shRNA組NF-κB蛋白的相對(duì)表達(dá)量(0.196±0.006)低于control-shRNA組(0.526±0.009)及HepG2/ADM組(0.552±0.023)表達(dá)降低，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，control-shRNA組與HepG2/ADM組NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；BC047440-shRNA組NF-κB蛋白抑制率為67.39%。

11、r>　　 5.Real time PCR檢測(cè)Survivin基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量，以β-actin為參照，BC047440-shRNA組Survivin基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量(2-△ct=0.018±0.001)較control-shRNA組(2-△ct=0.0415±0.0015)及HepG2/ADM組(2-△ct-0.048±0.002)降低，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，control-shRNA組與HepG2/A

12、DM組Survivin基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，BC047440-shRNA組Survivin基因mRNA相對(duì)表達(dá)量約為control-shRNA組的37%，約為HepG2/ADM組的42%；檢測(cè)CCNL1基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量，以β-actin為參照，BC047440-shRNA組CCNL1基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量(2-△ct=0.0995±0.0035)較control-shRNA組(2-△ct=0

13、.0285±0.0015)及HepG2/ADM組(2-△ct=0.0415±0.0015)升高，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，control-shRNA組和HepG2/ADM組CCNL1基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，BC047440-shRNA組CCNL1基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量約為control-shRNA組3.5倍，約為HepG2/ADM組2.4倍。
　　 結(jié)論：
　　 1.成功建