白花蛇舌草逆轉(zhuǎn)乏氧HepG-2細(xì)胞對(duì)ADM的耐藥性.pdf

1、目的：
　　建立乏氧HepG-2細(xì)胞模型，明確其對(duì)ADM具有耐藥性。探討白花蛇舌草是否能夠逆轉(zhuǎn)乏氧HepG-2細(xì)胞對(duì)ADM的耐藥性，并進(jìn)一步探討其可能的分子機(jī)制。
　　方法：
　　臺(tái)盼藍(lán)拒染色法觀察CoCl2作用后HepG-2細(xì)胞的存活率；MTT法測(cè)定白花蛇舌草對(duì)乏氧HepG-2細(xì)胞的抑制率；MTT法分別測(cè)定阿霉素作用于普通HepG-2細(xì)胞以及乏氧HepG-2細(xì)胞的IC50值，并計(jì)算其耐藥倍數(shù)（耐藥細(xì)胞組的IC50/敏

2、感細(xì)胞組的IC50）；MTT法測(cè)定白花蛇舌草作用于乏氧HepG-2細(xì)胞后對(duì)阿霉素的IC50值，并計(jì)算其耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)（未加逆轉(zhuǎn)劑組的IC50/加逆轉(zhuǎn)劑組的IC50）；流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率；Western Blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)HIF-1a、P-gp及MRP蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.含100 umol/L的CoCl2培養(yǎng)基培養(yǎng)HepG-2細(xì)胞可建立乏氧HepG-2細(xì)胞模型。
　　用0-200umol/L

3、不同濃度的CoCl2作用于HepG-2細(xì)胞4天，100umol/L以上濃度的CoCl2在培養(yǎng)至第3天時(shí)可使細(xì)胞40％以上全部死亡，而小于該濃度則細(xì)胞存活率可達(dá)到90%。因此，選用細(xì)胞最大的耐受劑量100umol/L濃度的CoCl2做為我們后續(xù)實(shí)驗(yàn)的用藥劑量。
　　2. CoCl2誘導(dǎo)的乏氧HepG-2細(xì)胞中HIF-1a的表達(dá)量增加。
　　Western Blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用100 umol/L的CoCl2建立的乏氧HepG-

4、2細(xì)胞中HIF-1a蛋白的表達(dá)量明顯高于普通HepG-2細(xì)胞(P<0.01)，并且其表達(dá)量具有時(shí)間依耐性。
　　3.乏氧HepG-2細(xì)胞對(duì)比普通HepG-2細(xì)胞無(wú)明顯形態(tài)學(xué)改變。
　　將分別用普通培養(yǎng)基和含100umol/L的CoCl2培養(yǎng)基培養(yǎng)72小時(shí)后所得的HepG-2細(xì)胞和乏氧HepG-2細(xì)胞，進(jìn)行瑞氏-吉姆薩染色，置于倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，兩種細(xì)胞之間并無(wú)明顯形態(tài)學(xué)差異。
　　4.白花蛇舌草對(duì)乏氧HepG-2細(xì)

5、胞的最大無(wú)毒劑量。
　　設(shè)置25、50、75----250mg/L共10個(gè)白花蛇舌草濃度梯度分別作用于乏氧HepG-2細(xì)胞，采用MTT法計(jì)算白花蛇舌草對(duì)乏氧HepG-2細(xì)胞的抑制率，并繪制出濃度作用曲線。選擇對(duì)細(xì)胞抑制率低于5%的25mg/L（最大無(wú)毒劑量）的白花蛇舌草作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度。
　　5.白花蛇舌草能夠部分逆轉(zhuǎn)乏氧HepG-2細(xì)胞對(duì)ADM的耐藥性。
　　5.1、白花蛇舌草能降低乏氧HepG-2細(xì)胞對(duì)ADM的IC

6、50值。
　　MTT法結(jié)果顯示：ADM作用于乏氧HepG-2細(xì)胞48h后的IC50值為19.21±0.32mg/L，明顯高于普通HepG-2細(xì)胞的IC50值2.31±0.23mg/L(P<0.001)。而加入白花蛇舌草后IC50值降為7.27±0.41mg/L，對(duì)比乏氧HepG-2細(xì)胞組有顯著性差異(P<0.01)，耐藥倍數(shù)和逆轉(zhuǎn)倍數(shù)分別為8.32倍和2.64倍。說(shuō)明乏氧HepG-2細(xì)胞對(duì)ADM具有耐藥性，而白花蛇舌草能夠部分逆轉(zhuǎn)

7、其耐藥性。
　　5.2、白花蛇舌草能夠加重ADM對(duì)乏氧HepG-2細(xì)胞的毒性作用。
　　2.5 mg/L ADM作用于三組細(xì)胞：HepG-2細(xì)胞、乏氧HepG-2細(xì)胞和白花蛇舌草+乏氧HepG-2細(xì)胞48小時(shí)，流式細(xì)胞儀測(cè)得凋亡率分別為58.20±3.76%、10.05±1.25%和25.42±2.34%。說(shuō)明白花蛇舌草能夠部分逆轉(zhuǎn)乏氧HepG-2細(xì)胞對(duì)ADM的耐藥性，加重ADM的細(xì)胞毒性作用。
　　6.白花蛇舌草逆轉(zhuǎn)

8、乏氧HepG-2細(xì)胞對(duì)ADM的耐藥性可能與其下調(diào)HIF-1a、P-gp、MRP蛋白的表達(dá)有關(guān)。
　　Western-blot結(jié)果顯示乏氧HepG-2細(xì)胞對(duì)比HepG-2細(xì)胞，其HIF-1a、P-gp和MRP蛋白表達(dá)量均明顯增加(P<0.01,P<0.01,P<0.001)，而加入白花蛇舌草后，則能明顯減少其蛋白表達(dá)量(P<0.05,P<0.05,P<0.05)。說(shuō)明HIF-1a、P-gp和MRP蛋白可能參與了乏氧HepG-2細(xì)胞對(duì)