RNAi沉默WT1基因逆轉(zhuǎn)惡性黑素瘤細(xì)胞耐藥性的研究.pdf

1、目的：惡性黑素瘤是一種高度惡性的皮膚腫瘤，其對(duì)常規(guī)化療藥物的耐藥性嚴(yán)重影響其預(yù)后，因而逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥性，以提高化療療效，是治療惡性黑素瘤的重要課題。目前認(rèn)為惡性黑素瘤耐藥的主要機(jī)制是凋亡抑制，越來(lái)越多研究證實(shí)特異性下調(diào)某些凋亡抑制基因以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，可以增加惡性黑素瘤對(duì)化療藥物的敏感性。WT1基因最早發(fā)現(xiàn)作為一種抑癌基因參與Wilm's瘤的發(fā)生，近年來(lái)研究證實(shí)WT1基因在多種實(shí)體瘤細(xì)胞中高表達(dá)，具有抑制腫瘤細(xì)胞凋亡作用，發(fā)揮癌基

2、因的作用。國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)WT1基因在80%以上惡性黑素瘤中表達(dá)，而在良性色素痣和正常皮膚中未見(jiàn)表達(dá)，下調(diào)WT1基因可以抑制惡性黑素瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。但抑制WT1基因表達(dá)能否逆轉(zhuǎn)惡性黑素瘤細(xì)胞的耐藥性尚未見(jiàn)報(bào)道。RNA干擾技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的基因沉默新技術(shù)，能高效，特異地抑制目的基因的表達(dá)，因此很快成為研究基因功能的重要工具。本研究旨在探討利用RNA干擾沉默WT1基因?qū)θ宿D(zhuǎn)移性惡性黑素瘤WM451細(xì)胞生長(zhǎng)，凋亡及其對(duì)順鉑敏感性的影

3、響，為惡性黑素瘤的基因治療提供理論依據(jù)。 方法： 1．構(gòu)建針對(duì)WT1基因的siRNA真核表達(dá)載體； 2．利用脂質(zhì)體將siRNA真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)入惡性黑素瘤WM451細(xì)胞中，并檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率； 3．利用RT-PCR、Western-Blot及免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法檢測(cè)WM451細(xì)胞中WT1基因mRNA及蛋白水平的表達(dá)，測(cè)定基因沉默效果； 4．用MTT法測(cè)定WM451細(xì)胞生長(zhǎng)曲線； 5．電鏡下觀察細(xì)

4、胞凋亡形態(tài)； 6．用MTT法檢測(cè)WM451細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。 結(jié)果： 1．成功構(gòu)建靶向WT1基因的siRNA真核表達(dá)載體； 2．RT-PCR檢測(cè)顯示W(wǎng)T1基因在惡性黑素瘤WM451細(xì)胞中高表達(dá)； 3．利用脂質(zhì)體為載體將siRNA真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染W(wǎng)M451細(xì)胞，轉(zhuǎn)染率為73%，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中WT1mRNA表達(dá)水平下降67%，蛋白表達(dá)水平下降67%； 4．RNA干擾沉默WT1基因可抑制細(xì)胞

5、增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡； 5．電鏡下可以看到凋亡細(xì)胞微絨毛減少，細(xì)胞核固縮，染色體邊集； 6．siRNA實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞IC50從9．37ug/ml降至4．13ug/ml，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)2．29，siRNA實(shí)驗(yàn)組WM451細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性增加。 結(jié)論： 1．靶向WT1的序列特異性siRNA可顯著抑制WT1基因的表達(dá)； 2．下調(diào)WM451細(xì)胞WT1基因表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡； 3．RNA干擾靶向