腺樣囊性癌NACC細(xì)胞系耐藥性誘導(dǎo)及青蒿琥酯對其順鉑耐藥性逆轉(zhuǎn)的研究.pdf

1、目的：建立化療耐藥的人涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞系，檢測其耐藥特性并初步探討青蒿琥酯（Artesunate，ART）對耐藥細(xì)胞是否具有增殖抑制及耐藥逆轉(zhuǎn)作用。
　　方法：以人涎腺腺樣囊性癌NACC為親本細(xì)胞，采用恒定3μM順鉑（Cisplatin，DDP），周期性作用的方法建立DDP耐藥的腺樣囊性癌細(xì)胞系；光鏡、電鏡觀察耐藥細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變；MTT法檢測其多藥耐藥性；平板克隆形成實驗檢測單個細(xì)胞增殖能力；MTT法繪制細(xì)胞生長曲線；流式細(xì)胞

2、儀檢測細(xì)胞周期分布情況；實時熒光定量PCR法檢測細(xì)胞中耐藥相關(guān)基因survivin、MRP2、ERCC1、CTR1的mRNA表達(dá)；Western Blot法檢測細(xì)胞中耐藥指標(biāo)survivin、MRP2、CTR1的表達(dá)。觀察ART對耐藥細(xì)胞增殖的影響，計算其IC50及IC05值，在IC05以下選擇下列濃度
　　37.5、75、150μM作為逆轉(zhuǎn)濃度，并選擇1/2 IC50（600μM）作對照濃度進(jìn)行后續(xù)實驗；ART干預(yù)親本及耐藥細(xì)胞

3、48 h后，光鏡、電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)改變；MTT法檢測37.5、75、150μM ART對耐藥細(xì)胞的DDP耐藥逆轉(zhuǎn)作用；流式細(xì)胞儀檢測37.5、75、150μM ART干預(yù)48 h后對親本細(xì)胞及耐目的：建立化療耐藥的人涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞系，檢測其耐藥特性并初步探討青蒿琥酯（Artesunate，ART）對耐藥細(xì)胞是否具有增殖抑制及耐藥逆轉(zhuǎn)作用。
　　方法：以人涎腺腺樣囊性癌NACC為親本細(xì)胞，采用恒定3μM順鉑（Cisplatin，

4、DDP），周期性作用的方法建立DDP耐藥的腺樣囊性癌細(xì)胞系；光鏡、電鏡觀察耐藥細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變；MTT法檢測其多藥耐藥性；平板克隆形成實驗檢測單個細(xì)胞增殖能力；MTT法繪制細(xì)胞生長曲線；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布情況；實時熒光定量PCR法檢測細(xì)胞中耐藥相關(guān)基因survivin、MRP2、ERCC1、CTR1的mRNA表達(dá)；Western Blot法檢測細(xì)胞中耐藥指標(biāo)survivin、MRP2、CTR1的表達(dá)。觀察ART對耐藥細(xì)胞增殖的影

5、響，計算其IC50及IC05值，在IC05以下選擇下列濃度
　　37.5、75、150μM作為逆轉(zhuǎn)濃度，并選擇1/2 IC50（600μM）作對照濃度進(jìn)行后續(xù)實驗；ART干預(yù)親本及耐藥細(xì)胞48 h后，光鏡、電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)改變；MTT法檢測37.5、75、150μM ART對耐藥細(xì)胞的DDP耐藥逆轉(zhuǎn)作用；流式細(xì)胞儀檢測37.5、75、150μM ART干預(yù)48 h后對親本細(xì)胞及耐藥細(xì)胞細(xì)胞周期的影響；Annexin V/PI雙染法

6、檢測37.5、150、600μM的ART干預(yù)48 h后對親本及耐藥細(xì)胞細(xì)胞凋亡的影響；實時熒光定量PCR法檢測37.5、75、150、600μM的ART干預(yù)耐藥細(xì)胞48 h后survivin、MRP2、ERCC1的mRNA表達(dá)變化；Western Blot法檢測37.5、75、150、600μM的ART干預(yù)耐藥細(xì)胞48 h后survivin、MRP2的蛋白表達(dá)變化。
　　結(jié)果：1.歷時7個月初步建立耐藥性較穩(wěn)定的腺樣囊性癌耐藥細(xì)胞

7、系，命名為NACC/DDP，光鏡下見NACC/DDP細(xì)胞體積較NACC明顯增大，可見多個核仁，呈不規(guī)則多角形。透射電鏡下見NACC/DDP細(xì)胞核仁增多，胞漿中粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)大量增生，同時可見大量脂滴及少量溶酶體。
　　2.MTT結(jié)果顯示NACC/DDP細(xì)胞不但對DDP產(chǎn)生了耐藥性，耐藥指數(shù)為2.16，而且對博來霉素、長春新堿也產(chǎn)生不同程度的交叉耐藥，耐藥指數(shù)分別為1.99和1.97。NACC/DDP細(xì)胞的克隆形成率（32.08±2.8

8、2）％顯著高于NACC細(xì)胞（23.52±2.72）%（P<0.01）。細(xì)胞生長曲線顯示NACC/DDP細(xì)胞生長速度快于NACC。與NACC細(xì)胞相比，NACC/DDP細(xì)胞的G0/G1期增加，S期和G2/M期減少。
　　3.NACC/DDP細(xì)胞中survivin、MRP2、ERCC1、CTR1的mRNA表達(dá)較NACC細(xì)胞上調(diào)。NACC/DDP細(xì)胞中survivin、MRP2、CTR1的蛋白表達(dá)較NACC細(xì)胞上調(diào)。
　　4.隨濃度

9、增加，ART對NACC/DDP細(xì)胞增殖抑制作用增強(qiáng)，ART對NACC/DDP細(xì)胞的IC50為1258.52±36.87μM，IC05為166.86±49.84μM，選擇藥物逆轉(zhuǎn)濃度為150、75、37.5μM，同時取1/2 IC50近似值600μM作對照。光鏡下見逆轉(zhuǎn)濃度各組NACC/DDP細(xì)胞僅有輕度形態(tài)變化，而600μM組可見大部分細(xì)胞死亡。經(jīng)150μM ART干預(yù)后，透射電鏡下見NACC及NACC/DDP細(xì)胞較加藥前細(xì)胞表面微絨毛

10、明顯減少，線粒體出現(xiàn)不同程度腫脹，胞質(zhì)呈不同程度空泡化改變，NACC細(xì)胞線粒體腫脹較NACC/DDP細(xì)胞嚴(yán)重。耐藥逆轉(zhuǎn)實驗結(jié)果顯示除37.5μM外，75μM和150μM ART可不同程度降低DDP對NACC/DDP細(xì)胞的IC50（P<0.05），部分逆轉(zhuǎn)NACC/DDP細(xì)胞對DDP的耐藥性，耐藥逆轉(zhuǎn)指數(shù)分別為1.29倍和1.70倍。
　　5.流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，37.5、75、150μM ART作用于NACC及NACC/DDP細(xì)胞

11、后，在加藥組，隨ART濃度增加，G0/G1期呈下調(diào)趨勢，S期和G2/M期呈上調(diào)趨勢，且同一濃度ART對兩種細(xì)胞的細(xì)胞周期影響基本相同。37.5、150、600μM ART均可不同程度促進(jìn)NACC及NACC/DDP細(xì)胞凋亡，且隨藥物濃度增加，凋亡率逐漸升高，相同濃度ART對NACC細(xì)胞凋亡率略高于NACC/DDP細(xì)胞，但差異尚無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　6.37.5、75、150、600μM的ART干預(yù)NACC/DDP細(xì)胞后，隨ART濃度增

12、加，survivin、MRP2、ERCC1的mRNA表達(dá)量均呈下調(diào)趨勢。37.5、75、150、600μM的ART干預(yù)NACC/DDP細(xì)胞后，survivin、MRP2的蛋白表達(dá)水平均顯著下調(diào)。
　　結(jié)論：1.NACC/DDP細(xì)胞具有多藥耐藥特性，屬于低等耐藥。與親本細(xì)胞NACC相比，其克隆形成率、生長速度、G0/G1期均顯著增加，而S期和G2/M期減少。NACC/DDP細(xì)胞中耐藥相關(guān)指標(biāo)survivin、MRP2、ERCC1表達(dá)