TRAIL誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞株K562-AO2凋亡及作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(Tumor Necrosisfactor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)屬于腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis factor，TNF)超家族新成員。TRAIL能快速、有效的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，而對(duì)大多數(shù)正常組織細(xì)胞沒(méi)有毒性<'[1]>。多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)一直是腫瘤化療的難題，也是急性白血病治療失

2、敗的主要原因之一。近年來(lái)，國(guó)外一些學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，TRAIL對(duì)經(jīng)化療誘導(dǎo)后的實(shí)體瘤多藥耐藥細(xì)胞株作用優(yōu)于其親本細(xì)胞<'[2]>，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果為克服MDR找到了新思路，目前針對(duì)血液系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞株研究的報(bào)道尚不多見(jiàn)。本實(shí)驗(yàn)研究TRAIL對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的人慢性粒細(xì)胞白血病紅白血病變耐藥細(xì)胞株K562/A02(mdr-1<'+>)的促凋亡作用及其機(jī)理，并聯(lián)合凋亡誘導(dǎo)劑As<,2>O<,3>以觀(guān)察其協(xié)同作用，為T(mén)RAIL作為一種新型的抗腫瘤生物制劑治療

3、多藥耐藥的急性白血病提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。 方法： 1 細(xì)胞株培養(yǎng)及傳代：人慢性粒細(xì)胞白血病紅白血病變細(xì)胞株K562、人慢性粒細(xì)胞白血病紅白血病變耐藥細(xì)胞株K562/A02，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病研究所提供。細(xì)胞培養(yǎng)于含10％滅活胎牛血清，青霉素100U/ml，鏈霉素100U/ml的RPMI1640培養(yǎng)液，5％CO2，飽和濕度，37℃的培養(yǎng)箱中，每2-3天傳代一次，實(shí)驗(yàn)用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。 2 K562及K562/A0

4、2細(xì)胞生物學(xué)檢測(cè) 3 TRAIL誘導(dǎo)K562、K562/A02細(xì)胞凋亡 4 采用MTT法檢測(cè)不同濃度TRAIL、As<,2>O<,3>單獨(dú)及聯(lián)合作用時(shí)對(duì)K562、K562/A02細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。單藥組分別加入終濃度為40、200、1000、2000、4000ng/ml的TRAIL和終濃度為1、2、5、10、25umol/L的As<,2>O<,3>；聯(lián)合用藥組分別加入終濃度為200、1000、2000、4000ng/m

5、l的TRAIL，然后分別加入終濃度為2umol/L As<,2>O<,3>，實(shí)驗(yàn)方法同2．25采用RT-PCR方法檢測(cè)K562、K562/A02細(xì)胞的NF-κB及TRAIL兩種死亡受體DR4、DR5和誘騙受體DcR1、DcR2mRNA表達(dá)水平，方法同2.1。引物序列如下：NF-κB(RelA/P65)上游引物5'-GTT CAC AGA CCT GGC ATCCGT-3'，下游引物5'-GAG AAG TCC ATG TCC GCAAT

6、G-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度240bp；DR4上游引物5'-CTG AGC AAC GCAGAC TCG CTG TCC AC-3'，下游引物5'-TCC AAG GACACG GCA GAG CCT GTG CCA T-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度506bp；DR5上游引物5'-GCC TCA TGG ACA ATG AGA TAA AGGTGG CT-3'，下游引物5'-CCAAAT CTC AAA GTA CGC ACAAAC GG-3'，擴(kuò)增片

7、段長(zhǎng)度502bp；DcR1上游引物5'-GAAGAA TTT GGT GCC AAT GCC ACT G-3'，下游引物5’-CTCTTG GAC TTG GCT GGG TTC ATG TCC TTC-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度612bp；DcR2上游引物5’-CTT TTC CGG CGG CGTTCA TGT CCT TC-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度453bp。 結(jié)果： 1 RT-PCR法檢測(cè)K562、K562/A02兩種細(xì)胞的m

8、dr-1表達(dá)水平，K562/A02高表達(dá)mdr-1(1.87±0.05)，K562不表達(dá)。K562 IC<,50>=2.55±0.28，K562/A02 IC<,50>=105.06±10.65，耐藥倍數(shù)=41.20>30倍，K562/A02可定為耐藥細(xì)胞。 2 倒置顯微鏡下觀(guān)察培養(yǎng)的K562、K562/A02細(xì)胞，在TRAIL作用下4小時(shí)時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞體積變小、變形、細(xì)胞膜發(fā)泡等凋亡現(xiàn)象，11小時(shí)時(shí)部分細(xì)胞被裂解成數(shù)個(gè)大小不等的小

9、體，同一時(shí)間觀(guān)察K562/A02較K562細(xì)胞形態(tài)變化明顯。光鏡下觀(guān)察到K562、K562/A02細(xì)胞在TRAIL作用24小時(shí)后細(xì)胞體積縮小，染色質(zhì)凝聚附在核膜周邊，嗜堿性增強(qiáng)，細(xì)胞核固縮呈均一的致密物，部分核碎裂，K562/A02較K562細(xì)胞形態(tài)變化明顯。 3 流式細(xì)胞儀定量檢測(cè)凋亡峰，發(fā)現(xiàn)K562、K562/A02細(xì)胞分別在各TRAIL濃度聯(lián)合或不聯(lián)合As<,2>O<,3>均發(fā)生細(xì)胞凋亡。200、1000、2000、400

10、0ng/mlTRAIL單藥作用下K562/A02組凋亡率逐漸增加，分別為19.33±0.13％，26.93±0.62％，34.93±0.10％，33.62±0.47％；K562組凋亡變化同K562/A02，分別為6.60±0.12％，8.26±0.03％，10.53±0.16％，9.87±0.07％，同一濃度下兩組細(xì)胞間皆有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別，K562/A02組凋亡作用優(yōu)于K562組(p<0.05)。2umol/L As<,2>O<,3>單藥作

11、用下K562/A02、 K562組凋亡率分別為5.90±0.47％，3.57±0.06％，K562/A02組As<,2>O<,3>單藥促凋亡作用優(yōu)于K562組(p<0.05)。2000ng,mlTRAIL聯(lián)合2umol/L As<,2>O<,3>作用下K562/A02、 K562組凋亡率分別為50.95±0.91％，20.75±0.95％， K562/A02組凋亡作用優(yōu)于K562組(p<0.05)，兩組均顯示較單藥凋亡率明顯提高(p<0

12、.05)，采用國(guó)內(nèi)金(正均)氏公式<'[3]>判斷TRAIL和As<,2>O<,3>聯(lián)合作用具有協(xié)同作用。 4 MTT分析細(xì)胞增殖抑制率：?jiǎn)斡肨RAIL在40-2000ng/ml劑量范圍內(nèi)，對(duì)K562、K562/A02細(xì)胞的增殖抑制作用具有劑量依賴(lài)性，TRAIL大于2000ng/ml以后繼續(xù)增加劑量效果不增加，TRAIL對(duì)K562/A02的敏感性?xún)?yōu)于K562，200ng/ml組差異最顯著(p<0.01)；單用As<,2>O<,3

13、>對(duì)K562、K562/A02細(xì)胞的增殖抑制作用與TRAIL一致，K562/A02優(yōu)于K562，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)；經(jīng)金(正均)氏公式判斷TRAIL和As<,2>O<,3>聯(lián)合作用協(xié)同性：結(jié)果顯示K562、K562/A02細(xì)胞在200、1000、2000、4000ng/ml TRAIL和2umol/L As<,2>O<,3>聯(lián)合應(yīng)用后Q值分別介于單純相加與增強(qiáng)之間(1.19～1.52)和(0.98～1.26)，提示TRAIL及

14、As<,2>O<,3>在殺傷K562、K562/A02細(xì)胞時(shí)具有協(xié)同作用。 5 RT-PCR法檢測(cè)K562、K562/A02兩種細(xì)胞NF-κBmRNA的表達(dá)情況，表達(dá)水平分別為(9.90±0.09)，(10.13±0.02)，均有較高表達(dá)，兩者無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差別(p>0.05)；TRAIL的DR4mRNA表達(dá)水平分別為(1.01±0.01)，(1.81±0.03)，DR5mRNA表達(dá)水平分別為(1.18±0.04)，(4.22±

15、0.06)，DR4、DR5在K562/A02中表達(dá)均高于K562，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差別(p<0.01)；DcRlmRNA表達(dá)水平分別為(0.25±0.01)， (0.05±0.03)，K562/A02較K562表達(dá)水平低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差別(p<0.01)，DcR2在兩種細(xì)胞中均不表達(dá)。 結(jié)論： 1 K562/A02高表達(dá)mdr-1，K562不表達(dá)，K562/A02的耐藥倍數(shù)達(dá)30倍以上，可鑒定為多藥耐藥細(xì)胞。 2

16、 TRAIL可誘導(dǎo)K562、K562/A02細(xì)胞凋亡，TRAIL、As<,2>O<,3>單藥及兩藥聯(lián)合對(duì)K562/A02促凋亡作用優(yōu)于K562，聯(lián)合作用優(yōu)于單藥。 3 As<,2>O<,3>對(duì)K562、K562/A02的敏感性與TRAIL一致。 4 在一定濃度范圍內(nèi)，TRAIL對(duì)腫瘤細(xì)胞K562、K562/A02的生長(zhǎng)抑制呈劑量依賴(lài)性，TRAIL和As<,2>O<,3>聯(lián)合作用于K562及K562/A02細(xì)胞，兩藥具有協(xié)