TRAIL聯(lián)合阿霉素誘導(dǎo)肝癌耐藥株凋亡及其機(jī)理的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：探討TRAILR在肝癌細(xì)胞HepG2和HepG2/ADM中的表達(dá)差異，TRAIL聯(lián)合阿霉素對肝癌耐藥株HepG2/ADM的治療作用。 方法：通過濃度遞增法用阿霉素處理人肝癌細(xì)胞株HepG2獲得肝癌耐藥株HepG2/ADM。并通過MTT方法鑒定耐藥株的耐藥性。RT-PCR、WesternBlot和免疫組化比較肝癌耐藥株HepG2/ADM與其親代HepG2的bcl-2、MDR1及TRAIL受體的mRNA和蛋白表達(dá)。采用Anne

2、xinV-FITC-PI雙染色流式細(xì)胞儀測TRAIL對肝癌耐藥株HepG2/ADM的凋亡誘導(dǎo)作用。 應(yīng)用可溶型TRAIL真核表達(dá)質(zhì)粒pIRES-EGFP-TRAIL。通過脂質(zhì)體Lipofectamine2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒入HepG2/ADM。通過RT-PCR和WesternBolt證實(shí)轉(zhuǎn)染的HepG2/ADM有sTRAIL的mRNA和蛋白的表達(dá)后，用MTT方法和AnnexinV-FITC-PI染色流式細(xì)胞儀檢測單純TRAIL處

3、理和聯(lián)合阿霉素處理HepG2/ADM的生長抑制率和凋亡率。并用共聚焦顯微鏡觀察處理后細(xì)胞凋亡的形態(tài)。 分別用阿霉素和其聯(lián)合TRAIL應(yīng)用處理肝癌耐藥株后，通過RT-PCR、WesternBlot和免疫組化比較肝癌耐藥株HepG2/ADMHepG2的DR4、DR5受體及bcl-2、NF-κB的mRNA和蛋白表達(dá)。應(yīng)用Rhodamine123染色通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞跨膜電位。應(yīng)用分光光度儀檢測細(xì)胞的capase8、caspase3

4、的表達(dá)。 結(jié)果：通過濃度遞增法用阿霉素處理人肝癌細(xì)胞株HepG2成功獲得肝癌耐藥株HepG2/ADM。肝癌耐藥株HepG2/ADM與其親代比較bcl-2、MDRl表達(dá)明顯增強(qiáng)，四種TRAIL受體兩者表達(dá)無明顯差異。TRAIL對肝癌耐藥株HepG2/ADM與其親代誘導(dǎo)的凋亡率無顯著性差異。sTRAIL轉(zhuǎn)染成功。用MTT測HepG2/ADM抑制率阿霉素處理組40.99±10.56％；TRAIL處理組28.72±7.64％；合用組58

5、.42±8.35％；聯(lián)合后抑制率有顯著差異。凋亡檢測為阿霉素處理組18.8±1.23％；TRAIL處理組14.38±1.02％；合用組49.74±1.85％。聯(lián)合TRAIL與阿霉素能明顯增加HepG2/ADM細(xì)胞的凋亡率。分別用阿霉素和其聯(lián)合TRAIL應(yīng)用處理肝癌耐藥株后，兩者間的DR4、DR5受體及bcl-2、NF-κB表達(dá)無明顯差異。阿霉素聯(lián)合TRAIL處理HepG2/ADM細(xì)胞能更加顯著的降低跨膜電位、激活caspase8、cas

6、pase3。 結(jié)論： 1.肝癌耐藥株HepG2/ADM與其親代HepG2都存在DR4、DR5受體和DcR1、DcR2受體表達(dá)。表達(dá)無顯著性差異。是TRAIL治療肝癌耐藥株的基礎(chǔ)。同時(shí)單純TRAIL治療對耐藥株作用與親代細(xì)胞作用相仿，受HepG2/ADM耐藥性的影響小。故TRAIL處理肝癌耐藥株有優(yōu)勢。 2.TRAIL聯(lián)合阿霉素能明顯增加肝癌耐藥株HepG2/ADM的凋亡。 3.TRAIL聯(lián)合阿霉素可能通過