Vernodalol增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)人彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株細(xì)胞凋亡及其機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　1.以DLBCL細(xì)胞株為研究對(duì)象，明確Vern的是否存在抗淋巴瘤活性以及其能否增強(qiáng)TRAIL抗淋巴瘤作用。
　　2.探究DR5和DR4在Vern增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)DLBCL細(xì)胞株細(xì)胞凋亡時(shí)的作用。
　　3.探究Vern是否以CHOP依賴模式增加DLBCL細(xì)胞株細(xì)胞DR5蛋白表達(dá)水平，以及CHOP在Vern增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)DLBCL細(xì)胞株細(xì)胞凋亡時(shí)的作用。
　　4.探究MAPKs信號(hào)途徑在Vern增強(qiáng)

2、TRAIL誘導(dǎo)DLBCL細(xì)胞株細(xì)胞凋亡時(shí)的作用。
　　5.探究凋亡相關(guān)蛋白在Vern增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)DLBCL細(xì)胞株細(xì)胞凋亡時(shí)的作用。
　　6.在BALB/c裸鼠模型中評(píng)價(jià)Vern是否能增強(qiáng)TRAIL抗DLBCL細(xì)胞株細(xì)胞作用。
　　方法:
　　1.不同濃度Vern聯(lián)合不同濃度TRAIL作用DLBCL細(xì)胞株Sudhl2、Sudhl4和Sudhl10細(xì)胞后，通過(guò)MTT方法測(cè)定細(xì)胞增殖力，流式細(xì)胞儀(FCM)Ann

3、exinⅤ/PI方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡以及Western blot方法檢測(cè)caspase激活情況。
　　2.Vern作用Sudhl2細(xì)胞后，通過(guò)Western blot、FCM和real-time PCR等方法檢測(cè)DR4和DR5的蛋白，mRNA和表面受體表達(dá)變化情況;利用siRNA沉默DR4和DR5基因，用MTT和FCM AnnexinⅤ/PI方法分別檢測(cè)Vern、TRAIL以及兩者聯(lián)合作用對(duì)Sudhl2細(xì)胞增殖和凋亡的影響。
　

4、　3.通過(guò)Western blot和real-time PCR檢測(cè)不同濃度Vern作用Sudhl2細(xì)胞后CHOP蛋白和mRNA表達(dá)水平變化;分別用轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯抑制劑干預(yù)后，Western blot檢測(cè)Vern對(duì)CHOP蛋白表達(dá)水平變化;siRNA沉默CHOP基因后用Western blot檢測(cè)DR5和DR4蛋白表達(dá)水平變化;siRNA沉默CHOP基因后用MTT和FCMAnnexinⅤ/PI方法檢測(cè)Vern、TRAIL以及兩者聯(lián)合作用對(duì)Su

5、dhl2細(xì)胞增殖和凋亡的影響。
　　4.Vern作用Sudhl2細(xì)胞后，Western blot方法檢測(cè)p-ERK1/2、ERK1、p-JNK、JNK、p-P38和P38蛋白表達(dá)水平變化;p38抑制劑(SB202190)、JNK抑制劑(SP600125)和ERK1/2抑制劑(PD98059)預(yù)處理Sudhl2細(xì)胞后，Western-blot檢測(cè)Vern對(duì)Sudhl2細(xì)胞CHOP和DR5蛋白表達(dá)水平影響。
　　5.Vern作用

6、Sudhl2細(xì)胞后，Westernblot方法檢測(cè)各種抗凋亡和促凋亡蛋白（Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1、Bad、Bak、Bax、Bid、XIAP、Survivin）蛋白表達(dá)水平變化;通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方法，使Sudhl2細(xì)胞過(guò)表達(dá)Mcl-1蛋白，用MTT和FCMAnnexinⅤ/PI方法檢測(cè)Vern、TRAIL以及兩者聯(lián)合作用對(duì)Sudhl2細(xì)胞增殖和凋亡的影響;siRNA沉默Sudhl2細(xì)胞Mcl-1基因，用MTT和FCM Anne

7、xinⅤ/PI方法檢測(cè)TRAIL對(duì)細(xì)胞凋亡和增殖的影響。
　　6.在BALB/c裸鼠模型中，皮下注射Sudhl2細(xì)胞，待腫瘤直徑到3mm-5mm后，瘤體周邊分別注射Vern、TRAIL以及兩者聯(lián)合注射，觀察腫瘤體積、重量變化以及小鼠體重變化。
　　結(jié)果:
　　1.Vern聯(lián)合TRAIL能明顯抑制DLBCL細(xì)胞株Sudhl2、Sudhl4和Sudhl10細(xì)胞增殖，并能增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)Sudhl2細(xì)胞凋亡作用。
　

8、　結(jié)果發(fā)現(xiàn)，只能誘導(dǎo)5％和10％左右的凋亡，兩者聯(lián)合凋亡率增加到30％左右;同時(shí)Western blot檢測(cè)到兩者聯(lián)合作用能激活caspase3，caspase8以及誘導(dǎo)PARP剪切。
　　2.Vern通過(guò)上調(diào)DR5蛋白表達(dá)來(lái)增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞增殖作用。
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)，siRNA沉默DR5基因能阻斷Vern增加TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制增殖作用，而DR4基因被siRNA沉默不能阻斷上述作用。
　　3

9、.Vern以CHOP依賴模式增加Sudhl2細(xì)胞DR5蛋白表達(dá)水平。
　　不同濃度Vern（0μM、5μM、10μM和20μM）作用Sudhl2細(xì)胞24h，通過(guò)Westernblot和realtimePCR方法檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著Vern作用濃度增加CHOP蛋白表達(dá)和mRNA表達(dá)水平均逐漸上調(diào)，并且呈劑量依賴性。預(yù)先用10mM放線霉素D(ACT)和放線（菌）酮(CHX)處理Sudhl2細(xì)胞株細(xì)胞1h，然后用20μMVern作用Su

10、dhl2細(xì)胞24h，再用Westernblot檢測(cè)CHOP蛋白表達(dá)水平變化，發(fā)現(xiàn)ACT和CHX能在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯水平分別抑制Vern誘導(dǎo)的CHOP蛋白表達(dá)。利用siRNA沉默CHOP基因后，用Westernblot檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Vern(20μM)誘導(dǎo)Sudhl2細(xì)胞DR5表達(dá)上調(diào)作用被明顯抑制;分別以Vern(20μM)、TRAIL(20ng/ml)以及兩者聯(lián)合作用DMSO培養(yǎng)基組、CHOP siRNA組和Scramble siRNA組S

11、udhl2細(xì)胞24h，然后用FCM AnnexinⅤ/PI和MTT方法檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CHOP siRNA組Vern增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞增殖作用明顯被減弱，而其他兩組觀察不到Vern增強(qiáng)TRAIL上述作用被減弱。
　　4.Vern通過(guò)介導(dǎo)JNK磷酸化激活誘導(dǎo)CHOP和DR5表達(dá)上調(diào)。
　　20μM Vern作用Sudhl2細(xì)胞0h、0.Sh、2h和6h后，Western blot檢測(cè)p-ERK1/2、ERK1

12、、p-JNK、JNK、p-P38和P38蛋白表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ERK和JNK被磷酸化激活，而P38沒(méi)有被磷酸化激活。預(yù)先用p38抑制劑(SB202190)、JNK抑制劑(SP600125)和ERK1/2抑制劑(PD98059)作用Sudhl2細(xì)胞1h，然后用Vern（20μM）處理Sudhl2細(xì)胞24h，Western blot檢測(cè)CHOP和DR5蛋白表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)JNK磷酸化抑制劑SP600125能以劑量依賴模式抑制CHOP和D

13、R5蛋白表達(dá)，而ERK1磷酸化抑制劑PD98059和p38磷酸化抑制劑SB202190對(duì)CHOP和DR5蛋白表達(dá)水平無(wú)影響。
　　5.下調(diào)Mcl-1表達(dá)與Vern增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞增殖作用相關(guān)。
　　不同濃度Vern（0μM、5μM、10μM和20μM）作用Sudhl2細(xì)胞24h后，Westernblot檢測(cè)各種抗凋亡和促凋亡蛋白(Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1、Bad、Bak、Bax、Bid、XIA

14、P、Survivin)表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Bad蛋白表達(dá)有輕微上調(diào)，Bcl-2表達(dá)有輕微下調(diào)，Mcl-1蛋白表達(dá)被明顯抑制，且呈劑量依賴性。Sudhl2細(xì)胞轉(zhuǎn)入過(guò)表達(dá)Mcl-1質(zhì)粒，然后分別以Vern（20μM）、TRAIL（20ng/ml）以及兩者聯(lián)合作用Sudhl2細(xì)胞24h，F(xiàn)CM AnnexinⅤ/PI方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，MTT檢測(cè)細(xì)胞抑制率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Mcl-1蛋白過(guò)表達(dá)可以明顯減弱Vern增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞增

15、殖作用。Sudhl2細(xì)胞轉(zhuǎn)入scramble siRNA或Mcl-1 siRNA，進(jìn)一步用TRAIL(20 ng/ml)作用細(xì)胞24h，F(xiàn)CM AnnexinⅤ/PI和MTT方法檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)Mcl-1基因被siRNA沉默后，TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞增殖作用明顯增強(qiáng)，且能明顯誘導(dǎo)PRAP剪切。
　　6.在BALB/c裸鼠體內(nèi)DLBCL模型中Vern同樣能增強(qiáng)TRAIL對(duì)DLBCL細(xì)胞株細(xì)胞毒作用。
　　在BALB/c裸鼠

16、中，皮下注射Sudhl2細(xì)胞，待腫瘤直徑到3mm-5mm后，瘤體周邊分別以生理鹽水、Vern（2mg/kg）、TRAIL(2mg/kg)和兩者聯(lián)合注射，每3天一次，總共8次，結(jié)果顯示，Vern(2mg/kg)、TRAIL(2mg/kg)一定程度抑制Sudhl2細(xì)胞在BALB/c裸鼠體內(nèi)成瘤，聯(lián)合用藥組能明顯抑制Sudhl2細(xì)胞在BALB/c裸鼠體內(nèi)成瘤且不明顯減少小鼠體重。
　　結(jié)論:
　　1.Vern能增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)D