藤黃酸誘導K562細胞株凋亡和自噬的研究凋亡和自噬相關(guān)蛋白在彌漫大B細胞淋巴瘤中的表達及意義.pdf

1、[目的]
　　一、研究藤黃酸(GA)對慢性髓性白血病(CML) K562細胞株的抑制增殖、誘導凋亡和自噬的作用，及其對BCR/ABL融合基因的影響，探討在該作用下凋亡和自噬的關(guān)系。
　　二、凋亡和自噬相關(guān)蛋白在彌漫大B細胞淋巴瘤(DLBCL)病理組織中的表達及其對預后的意義。
　　[方法]
　　一、不同濃度和時間的GA作用于K562細胞和正常骨髓單個核細胞(MNC)，采用CCK-8法檢測細胞活性;光鏡和Annex

2、inⅤ/PI雙染法觀察細胞的凋亡;通過透射電鏡(TEM)、單丹磺酰尸胺(MDC)、Western blot方法檢測K562細胞的自噬。實時熒光定量PCR(real time PCR)和熒光原位雜交(FISH)檢測K562細胞的BCR/ABL融合基因的表達。
　　二、采用免疫組化方法(IHC)檢測60例RCHOP方案化療的DLBCL患者的病理標本中Beclin1、Bcl2、MYC和Ki67蛋白的表達。
　　[結(jié)果]
　　

3、一、
　　1.GA呈時間和濃度依賴性地抑制K562細胞的增殖。其作用12、24、36和48h的IC50分別為2.27、1.50、1.16和1.04μM，其抑制率與時間和濃度的相關(guān)指數(shù)(r)分別為0.739和0.972（P均＜0.05）。另一方面，GA對正常骨髓MNC的毒性較K562細胞株明顯減弱(P＜0.05)，對應抑制K562細胞的各濃度和時間組的GA作用于MNC的抑制率均小于10％。
　　2.GA誘導K562細胞凋亡，光

4、鏡下細胞出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學改變，0.5、1.0和2.0μM GA作用K562細胞24h的早期凋亡率、晚期凋亡率和總凋亡率均隨著作用濃度的升高而增高，且與對照組的差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，其三種凋亡率和GA的濃度均呈顯著相關(guān)，r分別為0.941，0.864和0.919(P均＜0.05)。而同樣濃度的GA作用于MNC的總凋亡率均＜20％，1.0μM的 GA作用K562細胞和MNC的總凋亡率分別為54％和9.5％，其對K562細胞

5、的凋亡率是MNC的5.7倍(P＜0.05)。
　　3.GA誘導K562細胞自噬，在TEM下，1.0μM GA作用的K562細胞較對照組出現(xiàn)典型的自噬小體，MDC顯示熒光數(shù)量增多、強度增強，自噬蛋白Beclin1和LC3-Ⅱ的表達以及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值均較對照組顯著增加(P＜0.05)。
　　4.隨著GA作用濃度的增高，K562細胞BCR/ABL融合基因的表達明顯下降(P＜0.05)。
　　5.加用自噬抑制劑氯

6、喹抑制自噬后，GA誘導凋亡的作用較單用GA組明顯減弱(P＜0.05);而加用泛半胱氨酸蛋白酶(pan-caspase，PC)抑制劑Z-VAD-FMK抑制凋亡后，GA誘導自噬的作用明顯減弱(P＜0.05)。
　　二、
　　1.60例DLBCL患者，3年預期總生存率(OS)在MYC高表達組和低表達組為57％和96％(P＜0.05); Ki67高表達組和低表達組的OS為80.3％和90.3％(P＞0.05);Bcl2高表達組和低表

7、達組的OS為59.8％和90.3％(P＜0.05);Beclin1高表達組和低表達組的OS為82.3％和76.8％(P＞0.05)。
　　2.3年預期無進展生存率(PFS)在MYC高表達組和低表達組為50％和96％(P＜0.05);Ki67高表達組和低表達組的PFS為75.3％和90.3％(P＞0.05);Bcl2高表達組和低表達組的PFS為69.3％和80.8％(P＜0.05);Beclin1高表達組和低表達組的PFS為83.1

8、％和68.3％(P＞0.05)。
　　3.在雙重打擊的聯(lián)合危險分層模式中，MYC+Bcl2雙陽性組和非雙陽性組的3年預期OS分別為53.8％和92.8％(P＜0.05)，3年預期PFS分別為46.3％和87.8％(P＜0.05)，多因素分析顯示MYC+Bcl2雙陽性是3年預期OS的獨立預后因素(P＜0.05)。
　　4.在MYC+IPI的聯(lián)合危險分層模式中，高危組（高IPI[3-5分]且MYC高表達）、中危組（高IPI或MY

9、C高表達）和低危組（低IPI[0-2分]且MYC低表達）的3年預期OS分別為47.8％，81.3％和98.8％(P＜0.05)，3年預期PFS分別為41.8％，73.3％和97.3％(P＜0.05)，多因素分析顯示高IPI+MYC高表達是3年預期OS和PFS的獨立預后不良指標(P＜0.05)。而在單用IPI進行危險分層的模式中，高危組(IPI4-5)、中危組(IPI2-3)、低危組(IPI0-1)的3年預期OS分別為81.3％，79.3

10、％和99.8％(P＞0.05)，其3年預期PFS分別為60.8％，75.8％和99.8％(P＞0.05)。
　　[結(jié)論]
　　一、
　　1.在對正常骨髓MNC無明顯影響的濃度下，GA對K562細胞具有抑制增殖和誘導凋亡的作用。
　　2.GA對K562細胞有誘導自噬的作用。
　　3.GA下調(diào)K562細胞BCR/ABL融合基因的表達。
　　4.在GA的作用下，K562細胞的自噬和凋亡相互依賴/促進，抑制自