APR3蛋白的亞細胞學(xué)定位及其在細胞凋亡和自噬中的作用.pdf

1、目的：明確凋亡相關(guān)蛋白3（apoptosis related protein3，APR3）的亞細胞學(xué)定位，并探討其在細胞凋亡和自噬中的作用。
　　方法：采用生物信息學(xué)方法對APR3蛋白的信號肽、跨膜區(qū)、糖基化情況進行預(yù)測，并采用Real-time PCR和Western blot檢測APR3在小鼠各器官組織及多種細胞株中的表達。利用Percoll法蔗糖密度梯度離心技術(shù)獲得小鼠肝臟組織溶酶體組份，并進行Western blot分析，

2、檢測APR3蛋白與溶酶體膜標(biāo)記蛋白LAMP1在各亞細胞組份及溶酶體中的豐度；采用免疫熒光共聚焦方法探討 APR3與LAMP1或溶酶體示蹤劑Lyso-Tracker Red共同定位情況，以及構(gòu)建的APR3蛋白真核表達載體（pFUGW-APR3）表達的外源性APR3蛋白的亞細胞定位特征。APR3表達載體（pFUGW-APR3）和沉默載體（pLL3.7-APR3）轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞，采用CCK-8和xCELLigence活細胞計數(shù)法、碘化丙

3、啶染色細胞流式細胞術(shù)等，檢測APR3對細胞增殖活力、細胞周期、細胞溶酶體膜通透性、溶酶體腔pH、溶酶體腔多種酸性水解酶活性（如組織蛋白酶、酸性磷酸酶、酸性脂酶和β-半乳糖苷酶等）等的影響；采用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況，采用透射電鏡技術(shù)檢測細胞形態(tài)的變化；采用Western blot法檢測APR3對凋亡相關(guān)蛋白BAX、BAD、BCL-2和cleaved caspase3表達的影響，以及自噬相關(guān)標(biāo)記蛋白Beclin1和Map1LC3B表達

4、的影響；利用小劑量Rapamycin刺激后，觀察APR3蛋白對phos-mTOR和p62蛋白表達的影響。
　　結(jié)果：生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果顯示APR3是一個含有信號肽、單重跨膜的糖基化蛋白，Real-time PCR和Western blot檢測發(fā)現(xiàn)其在多種組織器官和細胞株中均有表達，其中在小鼠脾臟、腎臟、肝臟、肺、脂肪組織和部分腫瘤細胞株中具有相對較高的表達。對亞細胞器組份的Western blot檢測發(fā)現(xiàn)APR3蛋白與LAMP1蛋

5、白表達具有高度的重疊，免疫熒光雙染色結(jié)果也顯示APR3和LAMP1具有相同的細胞學(xué)定位特征，并且與溶酶體示蹤劑Lyso-Tracker Red具有相同的細胞器定位；NIH3T3細胞轉(zhuǎn)染外源表達質(zhì)粒后免疫熒光染色顯示外源性 APR3與Lyso-Tracker Red具有相同的細胞器定位，并且出現(xiàn)部分定位失真現(xiàn)象，即在細胞膜中亦出現(xiàn)表達。NIH3T3細胞株中外源性APR3蛋白過表達降低細胞的增殖活力，細胞出現(xiàn)細胞周期阻滯，阻滯于G1/S期，

6、同時伴細胞周期蛋白cyclin D1表達下降，細胞凋亡促進因子BAX、BAD和cleaved caspase3表達升高，凋亡抑制因子BCL-2表達下調(diào)，自噬相關(guān)標(biāo)記蛋白Beclin-1和Map1LC3B表達增加；外源性APR3蛋白過表達還使細胞溶酶體膜通透性增加，溶酶體腔pH降低，溶酶體腔組織蛋白酶B、酸性磷酸酶、酸性脂酶和β-半乳糖苷酶活性增加；與此相反，APR3基因沉默則使溶酶體膜通透性顯著下降，溶酶體腔pH升高，但不影響溶酶體腔相