干擾CXCR4表達對SHi-1細(xì)胞株生物學(xué)功能的研究.pdf

1、目的：
　　 構(gòu)建能特異性抑SHI-1細(xì)胞株趨化因子受體CXCR4(CXC chemokinereceptor type4)基因表達的慢病毒siRNA載體，轉(zhuǎn)染至SHI-1細(xì)胞中，降低CXCR4基因的表達，建立白血病細(xì)胞株SHI-1細(xì)胞與急性白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞(bonemarrow stromal cells，BMSCs)體外共培養(yǎng)模型，觀察干擾CXCR4表達后對SHI-1細(xì)胞體外增殖、黏附、侵襲能力的影響，并通過體內(nèi)裸鼠皮下成

2、瘤模型，進一步明確CXCR4與急性白血病臨床發(fā)生、發(fā)展和髓外浸潤間的關(guān)系。
　　 方法：
　　 1、參照文獻設(shè)計針對CXCR4的RNAi靶點序列，合成靶序列的Oligo DNA，退火形成雙鏈DNA，與經(jīng)Age I/BamH IN切后的GV248-EGFP載體連接產(chǎn)生RNA慢病毒載體GV248-LV，PCR鑒定陽性克隆并測序，將測序正確的GV248-LV、pHelper1.0和pHelper2.0質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體2000將共轉(zhuǎn)

3、染293T細(xì)胞，獲得重組慢病毒，用逐孔稀釋法測定病毒滴度。同理針對CXCR4陰性干擾序列，構(gòu)建陰性病毒，測定病毒滴度。
　　 2、分SHI-1細(xì)胞為SHI-1/CXCR4組、SHI-1/NC組和SHI-1組共3組，其中SHI-1/CXCR4組為SHI-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染特異性干擾CXCR4基因表達的慢病毒干擾載體，SHI-1/NC組為轉(zhuǎn)染含無關(guān)序列片段的慢病毒載體，SHI-1組不做任何處理，培養(yǎng)后，通過熒光顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)(FCM)觀

4、察各組SHI-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染病毒載體后的GFP熒光率，MTT法檢測3組細(xì)胞體外增殖能力的變化，通過半定量RT-PCR、實時熒光定量PCR(qPCR)、流式細(xì)胞術(shù)檢NCXCR4表達的改變。成功干擾SHI-1細(xì)胞CXCR4表達后，通過實時定量PCR檢NSHI-1細(xì)胞中MMP-2、MMP-9 mRNA的表達。
　　 3、體外培養(yǎng)急性非淋巴細(xì)胞白血病患者BMSCs，分別與3組細(xì)胞共培養(yǎng)24h，檢N3組細(xì)胞與BMSCs細(xì)胞之間黏附能力改變。<

5、br>　　 4、按1:10比例將BMSCs與三組SHI-1細(xì)胞接種于鋪有Matrigel基質(zhì)膠的Millicelid，室中，建立SHI-1細(xì)胞跨Matrigel侵襲模型，共培養(yǎng)24h后，觀察表達不同程度CXCR4的SHI-1細(xì)胞侵襲能力的改變。
　　 5、皮下成瘤模型：購買5-6周齡BALB/c裸鼠，分為3組，予環(huán)磷酰胺預(yù)處理后，分別給予左腋皮下注射SHI-1、SHI/NC、SHI-1/CXCR7細(xì)胞1X107/只，每組5只，

6、觀察腋下腫瘤大小，測量腫瘤體積和腫瘤重量。
　　 結(jié)果：
　　 (1)通過逐孔稀釋法，成功構(gòu)建了帶有GFP綠色熒光的可供轉(zhuǎn)染的慢病毒，測得陽性病毒滴度為8.00x108TU/ml，陰性病毒滴度為1.00×109TU/ml。
　　 (2)轉(zhuǎn)染細(xì)胞后FCM檢測SHI-1/CXCR4組GFP熒光率為93％、SHI-1/NC組為92％，MTT發(fā)現(xiàn)各組細(xì)胞間不同時間點的OD值無明顯差異(均p>0.05)。半定量RT-PCR

7、及qPCR檢測發(fā)現(xiàn)SHI-1/CXCR4組的CXCR4的表達下降76％，F(xiàn)CM檢測發(fā)現(xiàn)SHI-1/CXCR4組的CXCR4的表達被敲減了69.6％，而SHI-1/NC與SHI-1細(xì)胞之間無顯著差異。成功干擾SHI-1細(xì)胞CXCR4表達后，qPCR檢測發(fā)現(xiàn)SHI-1/CXCR4組的MMP-2、MMP-9 mRNA表達分別下降63％和62％，而SHI-1/NC組與SHI-1組間的MMP-2 mRNA及MMP-9 mRNA表達無明顯差異。

8、r>　　 (3)與BMSCs共培養(yǎng)24h后100倍顯微鏡下觀察到SHI-1/CXCR4組細(xì)胞的黏附能力明顯下降，計算骨髓基質(zhì)細(xì)胞對各組SHI-1細(xì)胞的黏附個數(shù)，SHI-1組為(56.1+5.1)，SHI-1/NC組為(57.6±5.4)、SHI-1/CXCR4組為(25.1±5.5)，SHI-1/CXCR4組的黏附率較SHI-1組和SHI-1/NC組顯著降低(p<0.01)，而SHI-1組與SHI-1/NC組之間無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(p>

9、0.05)。
　　 (4)單獨的SHI-1細(xì)胞不能跨Matrigel基質(zhì)膠向Millicell下層移行，與BMSCs共培養(yǎng)24h后，SHI-1細(xì)胞跨Matrigel基質(zhì)膠向下層移行能力顯著提高，24h后移行至下層的細(xì)胞占接種細(xì)胞數(shù)的比例分別為SHI-1+BMSCs(20.3±3.7)％；SHI-1/NC+BMSCs(19.6±4.2)％；SHI-1/CXCR4+BMSCs(9.2±2.1)％。SHI-1/CXCR4組與SHI-1

10、組及SHI-1/NC組相比侵襲力顯著下降(p<0.01)，而SHI-1組與SHI-1/NC組之間無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(p>0.05)。
　　 (5)皮下成瘤模型發(fā)現(xiàn)SHI-1/CXCR4細(xì)胞組的皮下成瘤能力完全被抑制。SHI-1及SHI-1/NC細(xì)胞組裸鼠皮下形成的腫瘤重量和體積之間無明顯差異(p>0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 (1)成功構(gòu)建可抑制CXCR4基因表達的慢病毒siRNA載體，可供進一步
　　

11、 實驗研究。
　　 (2)轉(zhuǎn)染慢病毒載體后SHI-1細(xì)胞的CXCR4的表達被成功干擾，且MMP-2、MMP-9 mRNA的表達也下降。SHI-1/CXCR4細(xì)胞的體外增殖能力無明顯變化，但黏附能力明顯下降，提示CXCR4參與的細(xì)胞通路可影響SHI-1細(xì)胞的黏附功能。
　　 (3)在白血病患者BMSCs與白血病SHI-1細(xì)胞接觸時，SHI-1細(xì)胞跨Matrigel基質(zhì)膠能力提高，干擾CXCR4表達后，其侵襲能力下降，可能是

12、BMSCs與SHI-1細(xì)胞通過CXCR4及MMP-2、MMP-9等來誘導(dǎo)SHI-1細(xì)胞跨Matrigel侵襲能力提高，為白血病細(xì)胞向髓外浸潤的重要機制之一。
　　 (4)皮下成瘤模型結(jié)果表明，干擾CXCR4表達后，SHI-1細(xì)胞在裸鼠皮下成瘤能力被完全抑制，提示CXCR4在白血病細(xì)胞的生長、定植及局部浸潤起到了重要作用。
　　 綜上所述：基因沉默CXCR4的表達后，SHI-1細(xì)胞株的黏附能力、體外侵襲能力及裸鼠皮下成瘤率