CXCR4表達(dá)在衰老骨髓細(xì)胞中的變化及其對血管再生功能的影響.pdf

1、實驗背景：
　　 隨著社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，心腦血管疾病的發(fā)病率日益增高。動脈閉塞作為冠心病、腦血管意外和下肢缺血的共同病因，其發(fā)病率在老年人群中漸增。利用人體自身的細(xì)胞來生成新血管的細(xì)胞替代治療作為一種低成本、低風(fēng)險的治療方案已越來越受重視。不幸的是，可能從中受益最大的老年患者體內(nèi)可用的祖細(xì)胞數(shù)量及其血管生成能力均已極度衰減。
　　 骨髓源性干細(xì)胞(BMCs)具有多向分化能力，并能提供支持血管生長和成熟的蛋白質(zhì)，從而促進(jìn)新生

2、血管生成?；|(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(SDF-1)是動員骨髓細(xì)胞和促進(jìn)細(xì)胞向靶組織歸巢的過程中的關(guān)鍵性趨化因子。SDF-1通過與靶細(xì)胞表面受體CXCR4結(jié)合并激活CXCR4而起作用。不同類型的細(xì)胞表面CXCR4的表達(dá)各不相同，而通過適當(dāng)?shù)捏w外培養(yǎng)可以增加其表達(dá)。我們過去的研究表明，鈣處理可提高對骨髓細(xì)胞表面CXCR4的表達(dá)。BMCs表面CXCR4的表達(dá)水平?jīng)Q定了細(xì)胞向靶組織歸巢及隨后血管生成的效率。MSCs或CD34+細(xì)胞CXCR4的過度表達(dá)

3、，在體外實驗中會增強(qiáng)這些細(xì)胞向SDF-1的遷移，在體內(nèi)實驗中則能增加骨髓移植的療效，這些都很可能歸功于細(xì)胞存活和歸巢的增加。但是，老年人骨髓中所含有的干細(xì)胞祖細(xì)胞在治療和修復(fù)功能方面有所缺陷。無論動物或人類，其EPC水平和功能均因衰老、糖尿病、缺血性心臟病和動脈粥樣硬化而受到不利影響，血管生成功能也因衰老而受損，然而這些因素在分子層面的影響尚不明確。
　　 實驗?zāi)康模?br>　　 研究骨髓細(xì)胞CXCR4表達(dá)是否因衰老而有所缺陷

4、，從而使骨髓中CXCR4+祖細(xì)胞的數(shù)量減少，并進(jìn)一步導(dǎo)致骨髓細(xì)胞向缺血組織的歸巢能力及促血管新生能力的受損。并對可能的機(jī)制進(jìn)行探討。
　　 實驗方法：
　　 應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測全骨髓細(xì)胞表面及細(xì)胞內(nèi)CXCR4的表達(dá)，分別根據(jù)骨髓細(xì)胞表面抗原的不同和細(xì)胞大小的不同對其進(jìn)行分群，并對不同細(xì)胞亞群表面CXCR4的表達(dá)進(jìn)行檢測；應(yīng)用real-time PCR技術(shù)檢測CXCR4的mRNA表達(dá)；從基因轉(zhuǎn)錄、蛋白表達(dá)及蛋白內(nèi)移能力等不

5、同水平、不同細(xì)胞亞群研究衰老對CXCR4表面表達(dá)的影響。通過1mM氯化鈣作為細(xì)胞外刺激因子短期處理骨髓細(xì)胞，研究BMCold CXCR4對細(xì)胞外刺激因子的反應(yīng)是否與BMCyoung有所區(qū)別。通過測定骨髓細(xì)胞與氯化鈣混合后細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的升高對鈣離子內(nèi)流進(jìn)行分析，研究衰老對細(xì)胞鈣內(nèi)流的影響，從而解釋衰老細(xì)胞CXCR4對鈣刺激不敏感的原因。應(yīng)用Western Blot技術(shù)檢測SDF-1/CXCR4的下游信號通路AKT和ERK1/2的磷酸化

6、水平，以研究衰老對SDF-1/CXCR4的下游信號通路的影響。應(yīng)用改進(jìn)的Boyden小室法檢測BMC的遷移能力；又以細(xì)胞粘附試驗檢測SDF-1介導(dǎo)的BMC向HUVEC單細(xì)胞層的粘附能力，以垂直膠原凝膠侵襲試驗檢測骨髓細(xì)胞穿越內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力，從而在體外模擬CXCR4+的BMCs在體內(nèi)先被SDF-1捕獲，緊密粘附于血管內(nèi)皮細(xì)胞表面，再完成跨內(nèi)皮細(xì)胞遷移至受損組織的過程；建立小鼠后肢缺血模型，經(jīng)尾靜脈注射輸入骨髓細(xì)胞，再分別通過免疫組化和

7、激光多普勒灌注成像術(shù)(LDPI)檢測在缺血組織內(nèi)不同骨髓細(xì)胞的增殖、歸巢和血管生成，從而研究衰老引起CXCR4表達(dá)受損是否進(jìn)一步影響細(xì)胞的功能。通過骨髓細(xì)胞移植對接受致死量的放射線照射后的骨髓重建研究年輕和老年微環(huán)境對骨髓細(xì)胞CXCR4表達(dá)的影響。
　　 實驗結(jié)果：
　　 小鼠后肢缺血模型中老年小鼠在2和3周時缺血肢體灌注的恢復(fù)明顯低于年輕小鼠，并且SDF-1治療也沒有提高灌注量。相較于年輕小鼠，老年小鼠中向缺血部位歸巢

8、的祖細(xì)胞更少，且對SDF-1處理更不敏感，導(dǎo)致其血管新生反應(yīng)受損。
　　 通過流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，BMCold表面表達(dá)CXCR4的細(xì)胞數(shù)量更少，且每一個細(xì)胞表面的CXCR4表達(dá)更少。鈣離子處理可以增強(qiáng)BMCyoung中CXCR4的表達(dá)，但老年小鼠細(xì)胞表面CXCR4的表達(dá)卻對鈣離子的刺激并不敏感。而其原因可能是BMCold的鈣內(nèi)流缺陷使CXCR4基因轉(zhuǎn)錄水平降低，從而導(dǎo)致鈣誘導(dǎo)CXCR4表達(dá)反應(yīng)受損。在不同的BMC亞群中，除了BM

9、Cyoung中的Lin-細(xì)胞明顯多于BMCold外，其余亞群細(xì)胞量在BMCyoung和BMCold間沒有顯著差異。Lin-Sca-1+亞群表面CXCR4的表達(dá)，年輕小鼠顯著高于老年小鼠，而兩者之間CD34+Flk1+亞群、Gr-1+CD11b+亞組的CXCR4表達(dá)沒有顯著差異。而根據(jù)細(xì)胞大小對BMC進(jìn)行分組后，“小細(xì)胞”亞群總是具有更高的表面CXCR4表達(dá)量。鈣處理所致亞群CXCR4表達(dá)的增長在BMCold亞群中也明顯要少很多。

10、　　 SDF-1與其受體CXCR4的結(jié)合會使CXCR4向細(xì)胞內(nèi)移位。BMCold CXCR4的這種內(nèi)移反應(yīng)正常，其與BMCyoung的主要區(qū)別在于基礎(chǔ)CXCR4表達(dá)的降低及其對鈣處理應(yīng)答的缺乏。在SDF-1/CXCR4的下游信號通路的反應(yīng)方面，BMCyoung對鈣刺激提高細(xì)胞內(nèi)通過SDF-1/CXCR4相互作用的信號通路活性更為敏感，而BMCold中SDF-1/Akt通路受到了抑制。另一方面，ERK1/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路則未發(fā)生改變。

11、r>　　 在體外試驗中，BMCold的粘附能力、向SDF-1的遷移能力和跨內(nèi)皮細(xì)胞的侵襲能力均受損。而通過相互的骨髓細(xì)胞移植發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)微環(huán)境的改變并不能改變骨髓細(xì)胞CXCR4表達(dá)和對SDF-1的遷移能力。在體內(nèi)試驗中，由SDF-1介導(dǎo)的BMCold向缺血肌肉歸巢的能力受損，血管生成能力受損，且不因鈣處理而提高。
　　 實驗結(jié)論：
　　 相較于BMCyoung，BMCold：(1)表面CXCR4表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)CXCR4的濃

12、度均降低了；(2)對細(xì)胞外輔助劑如鈣對細(xì)胞表面CXCR4表達(dá)的刺激的敏感性降低；(3)明顯降低的鈣內(nèi)流和鈣刺激不能使CXCR4 mRNA表達(dá)量增加；(4)SDF-1介導(dǎo)的CXCR4內(nèi)移對鈣刺激的反應(yīng)極大地減少；(5)相應(yīng)于SDF-1處理的Akt磷酸化幾乎完全受抑。
　　 而衰老對骨髓細(xì)胞CXCR4表達(dá)的這些影響也轉(zhuǎn)化成了以下的功能障礙：(1)骨髓細(xì)胞未能向SDF-1濃度梯度遷移；(2)鈣不能加強(qiáng)這方面的遷移能力；(3)骨髓細(xì)胞在