過表達CXCR4的骨髓間質(zhì)干細胞移植治療大鼠腦梗死的療效觀察.pdf

1、腦梗死是中老年人致殘的主要疾病之一，目前對腦梗死的治療尚缺乏理想的方法。在腦缺血損傷模型中，通過動、靜脈注射的骨髓間質(zhì)干細胞(MSCs)都能夠遷移、聚集到損傷部位表明局部缺血微環(huán)境可能表達某些信號以促使循環(huán)中的MSCs遷移到該區(qū)域。目前，大多數(shù)學者傾向于用基質(zhì)細胞衍生因子-1(SDF-1)及其唯一特異性受體CXCR4的相互作用來解釋這一現(xiàn)象。SDF-1/CXCR4在骨髓干細胞的動員和歸巢、內(nèi)皮細胞的遷移、血管的發(fā)生、粘附分子表達、移植細

2、胞增殖和存活方面起到重要作用。研究表明組織損傷后，損傷部位分泌的SDF-1與血循環(huán)中MSCs表達的CXCR4相互作用對MSCs產(chǎn)生向損傷組織的趨化聚集，在移植細胞向損傷部位遷移中發(fā)揮重要作用。由于CXCR4在MSCs的表達率比較低，可能影響其向損傷部位遷移。因此我們設想通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將外源性CXCR4基因?qū)隡SCs，并推測提高CXCR4在MSCs的表達率能增強MSCs向腦梗死區(qū)組織的趨化聚集。因此本實驗構(gòu)建表達CXCR4的慢病毒載體，

3、并轉(zhuǎn)導rMSCs，采用體內(nèi)、體外實驗觀察過表達CXCR4基因的rMSCs是否具有較高的細胞遷移率，及過表達CXCR4基因的rMSCs移植治療腦梗死是否有更好效果。本研究分為四個部分。
　　 第一部分：CXCR4重組慢病毒載體(pNL-CXCR4-IRES2-EGFP)的構(gòu)建及鑒定。
　　 方法：⑴根據(jù)Genbank大鼠CXCR4編碼區(qū)序列全長及兩端酶切位點需要設計上下游引物；⑵用RT-PCR方法從大鼠肝臟獲取CXCR4的

4、cDNA；⑶雙酶切將pNL-IRES2-EGFP慢病毒載體的線性化與含有CXCR4基因片段連接，轉(zhuǎn)化，小量抽提質(zhì)粒DNA，進行雙酶切、PCR及測序鑒定。
　　 結(jié)果：酶切鑒定和測序都證實pNL-CXCR4-IRES2-EGFP質(zhì)粒構(gòu)建正確。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建大鼠CXCR4基因重組慢病毒載體(pNL-CXCR4-IRES2-EGFP)。
　　 第二部分：建立過表達CXCR4骨髓間充質(zhì)干細胞系(CXCR4-rMS

5、Cs)。
　　 方法：⑴將三質(zhì)粒pNL-CXCR4-IRES2-EGFP、pHELPER和pVSVG共轉(zhuǎn)染293T細胞，包裝生產(chǎn)慢病毒；⑵經(jīng)超速離心收集病毒顆粒，轉(zhuǎn)導293T細胞，用流式細胞術(shù)測定EGFP蛋白表達率來測定慢病毒功能滴度；⑶用相同滴度的轉(zhuǎn)CXCR4基因慢病毒、空載體慢病毒、CXCR4基因沉默慢病毒(由本課題組的前期研究所構(gòu)建)轉(zhuǎn)導rMSCs，建立穩(wěn)定過表達CXCR4基因細胞系CXCR4-rMSCs；⑷用RT-PCR

6、、Western Blot、細胞免疫熒光組織化學和流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)CXCR4基因rMSCs組(CXCR4-rMSCs組)、轉(zhuǎn)空載體rMSCs組(null-rMSCs組)及CXCR4基因沉默rMSCs組(siRNA-rMSCs組中CXCR4表達情況。
　　 結(jié)果：①三質(zhì)粒pNL-CXCR4-IRES2-EGFP、pHELPER和pVSVG共轉(zhuǎn)染293T細胞，包裝產(chǎn)生慢病毒。②轉(zhuǎn)CXCR4基因、空載體及CXCR4基因沉默rMSCs強

7、烈表達EGFP。③RT-PCR、Western Blot、細胞免疫熒光組織化學和流式細胞術(shù)一致證實CXCR4-rMSCs組強烈表達CXCR4，siRNA-rMSCs組的CXCR4表達明顯被抑制。
　　 結(jié)論：成功建立穩(wěn)定過表達CXCR4骨髓間充質(zhì)細胞系(CXCR4-rMSCs)。
　　 第三部分：SDF-1α對rMSCs遷移作用的體外研究。
　　 方法：⑴體外實驗在內(nèi)置8μm孔徑聚碳酸酯膜的48孔微遷移板中進行，

8、趨化因子SDF-1α以不同濃度加入到遷移板下室，CXCR4-rMSCs、null-rMSCs及siRNA-rMSCs加入到上室，觀察細胞遷移情況，計算細胞遷移指數(shù)；⑵抗CXCR4多抗阻斷后各組rMSCs，觀察細胞遷移情況，計算細胞遷移指數(shù)。
　　 結(jié)果：①SDF-1α可明顯促進rMSCs的跨膜遷移，而且在一定濃度范圍隨著SDF-1α濃度梯度增高而增強。②相同濃度SDF-1α作用下CXCR4-rMSCs跨膜細胞遷移指數(shù)明顯高于nu

9、ll-rMSCs及siRNA-rMSCs。③CXCR4-rMSCs及null-rMSCs抗體阻斷后遷移指數(shù)明顯下降，與抗體阻斷前差別有顯著性意義；siRNA-rMSCs抗體阻斷前與抗體阻斷后遷移指數(shù)無顯著改變。
　　 結(jié)論：體外微遷移板實驗表明，表達于rMSCs表面的CXCR4在SDF-1α介導rMSCs跨膜遷移中起很重要作用。
　　 第四部分：rMSCs靜脈移植后的遷移、分化及對腦梗死保護作用的研究。
　　 方

10、法：⑴取健康成年雄性SD大鼠分為四組：①CXCR4-rMSCs移植組；②null-rMSCs移植組；③siRNA-rMSCs移植組；④PBS組，在MCAO后24h將各組rMSCs或PBS經(jīng)股靜脈注入大鼠體內(nèi)，在MCAO后7天觀察以下各指標；⑵體視熒光顯微鏡下觀察EGFP+細胞的分布情況；⑶TTC染色測定腦梗死體積；⑷檢測各組大鼠神經(jīng)功能(mNSS)評分的變化；⑸免疫熒光組化觀察CXCR4表達、神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞及內(nèi)皮細胞表面標志觀察；

11、⑹激光掃描共聚焦顯微鏡觀察梗死灶周邊區(qū)腦血流灌注量。
　　 結(jié)果：①移植EGFP+rMSC主要存在于大鼠的腦梗死半球大腦皮質(zhì)、皮質(zhì)下和海馬等處，對側(cè)半球只可見少量EGFP+細胞。CXCR4-rMSCs移植組腦梗死半球特別在缺血半暗帶區(qū)EGFP+rMSC明顯多于其他各組，siRNA-rMSCs移植組腦梗死半球缺血區(qū)EGFP+rMSC明顯少于null-rMSCs移植組，PBS組大鼠大腦兩側(cè)未發(fā)現(xiàn)EGFP+細胞聚集。②MCAO后7天C

12、XCR4-rMSCs和null-rMSCs兩移植組腦梗死體積均低于PBS組及siRNA-rMSCs移植組，差異有顯著性意義，且CXCR4-rMSCs移植組腦梗死體積明顯低于null-rMSCs移植組，兩移植組間差別亦有顯著性意義。③MCAO后7天CXCR4-rMSCs和null-rMSCs移植組mNSS評分均低于PBS組及siRNA-rMSCs移植組，差異有顯著性意義，且CXCR4-rMSCs和null-rMSCs兩移植組間mNSS評分

13、差別亦有顯著性意義，CXCR4-rMSCs移植組功能恢復明顯優(yōu)于null-rMSCs移植組。④大部分移植EGFP陽性細胞表達CXCR4蛋白，小部分移植EGFP陽性細胞表達神經(jīng)元標記物NSE、星形膠質(zhì)細胞標記物GFAP或血管內(nèi)皮細胞標記物vWF。⑤MCAO后7天CXCR4-rMSCs和null-rMSCs兩移植組梗死灶周邊區(qū)腦血流灌注量均高于PBS組及siRNA-rMSCs移植組，差異有顯著性意義，CXCR4-rMSCs移植組梗死灶周邊區(qū)