人CXCR4基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞提高急性心肌梗死移植后歸巢性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分:攜帶hCXCR4基因慢病毒載體的構(gòu)建及豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染
　　目的:利用含有人CXCR4基因的質(zhì)粒，構(gòu)建慢病毒載體，將構(gòu)建好的慢病毒載體轉(zhuǎn)染分離、培養(yǎng)的豬MSCs，觀察MSCS hCXCR4的表達(dá)。方法貼壁離心法分離并培養(yǎng)小型豬骨髓源性MSCs，將含人CXCR4基因的質(zhì)粒進(jìn)行PCR、酶切、連接、轉(zhuǎn)化、挑克隆進(jìn)行質(zhì)粒提取鑒定，進(jìn)行病毒包裝、濃縮后，轉(zhuǎn)染MSCs構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。
　　結(jié)果:從小型豬骨髓體

2、外成功分離、純化并擴(kuò)增MSCs，慢病毒Lenti6.3-hCXCR4-IRES-EGFP轉(zhuǎn)染MSCs，并穩(wěn)定高表達(dá)人CXCR4。結(jié)論成功構(gòu)建了Lenti6.3-hCXCR4-IRES2-EGFP穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的豬MSCs細(xì)胞系，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。
　　第二部分: hCXCR4基因修飾的豬MSCs體外趨化實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:將hCXCR4基因修飾的豬MSCs，在體外利用Transwell體外遷移體系探討SDF-1-CXCR4

3、對(duì)MSCs遷移、趨化能力的影響。
　　方法:慢病毒顆粒Lenti6.3-hCXCR4-IRES2-EGFP及l(fā)enti-nega-EGFP穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MSCs，通過Transwell體外遷移系統(tǒng)，采用0、100、200、300ng/ml四個(gè)SDF-1濃度組在體外進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，觀察其對(duì)基因轉(zhuǎn)染的MSCs的趨化效應(yīng);并利用5-aza誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染的MSCs，觀察其分化能力。結(jié)果體外5-aza誘導(dǎo)后，部分基因修飾的MSCs成梭形，結(jié)蛋白、肌球蛋白

4、重鏈、心肌特異性肌鈣蛋白Ⅰ免疫細(xì)胞化學(xué)染色均為陽(yáng)性。MSCs-hCXCR4有隨SDF-1濃度增加而趨化增加的趨勢(shì)，但其增加的趨勢(shì)至300ng/ml時(shí)明顯減弱。CXCR4拮抗劑AMD3100可明顯抑制但不能完全阻斷SDF-1-CXCR4相互作用引起的趨化效應(yīng)。結(jié)論轉(zhuǎn)染hCXCR4基因并未改變MSCs的細(xì)胞增殖活動(dòng)周期，體外誘導(dǎo)可分化成心肌樣細(xì)胞。高表達(dá)hCXCR4的MSC體外對(duì)SDF-1α趨化活性顯著增加。
　　第三部分: hCXC

5、R4基因修飾的MSCs移植治療豬急性心肌梗死的研究
　　目的:探討人CXCR4基因修飾后的同種異體MSCs移植治療豬急性心肌梗死的作用。方法從小型豬骨髓體外成功分離、純化并擴(kuò)增MSCs，慢病毒Lenti6.3-hCXCR4-IRES-EGFP及l(fā)enti-nega-EGFP轉(zhuǎn)染MSCs。前降支封堵法建立雌性小型豬急性心肌梗死模型，分為生理鹽水組、MSCs+NEGA組、MSCs+hCXCR4組，進(jìn)行雄性源性MSCs移植。細(xì)胞移植后1

6、周、1月、3月行磁共振檢測(cè)并于1周、1月、3月時(shí)分別處死部分動(dòng)物，取心臟標(biāo)本行相關(guān)檢查。結(jié)果成功建立雌性小型豬急性心肌梗死模型。組織學(xué)分析顯示MSCs+hCXCR4組細(xì)胞移植后1周、1月時(shí)較對(duì)照組顯著高表達(dá)hCXCR4，并可檢測(cè)到Y(jié)染色體特異性SPY基因;至3月時(shí)均未檢測(cè)到;MSCs+hCXCR4組細(xì)胞移植后1周、1月、3月時(shí)較對(duì)照組顯著高表達(dá)VEGF，同時(shí)毛細(xì)血管及小動(dòng)脈密度明顯增加;同時(shí)MRI檢查顯示1月、3月時(shí)其心功能較對(duì)照有不同

7、程度的改善。結(jié)論人CXCR4基因轉(zhuǎn)染MSCs后移植更加增強(qiáng)其治療心肌梗死的作用，其機(jī)制可能系通過增強(qiáng)其旁分泌作用實(shí)現(xiàn)。
　　第四部分:急性心肌梗死誘導(dǎo)心肌細(xì)胞進(jìn)入分裂周期的初步探討
　　目的:探討急性心肌梗死后是否有心肌細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期并進(jìn)行細(xì)胞分裂。方法前降支結(jié)扎法制作制作SD大鼠急性心肌梗死模型，分別于梗死后3天、1周、2周、3周、4周各處死5只，及5只假手術(shù)大鼠，取出心臟組織，做Masson染色，使用免疫組化法測(cè)c