CXCR4基因沉默和SDF-1α對骨髓間質(zhì)干細胞腦內(nèi)遷移的影響.pdf

1、缺血性腦卒中是中老年人致死致殘的主要疾病之一，目前尚無有效藥物能夠阻止腦缺血和再灌注損傷引起的多重神經(jīng)損害。許多動物實驗表明，骨髓間質(zhì)干細胞(MSCs)經(jīng)全身或局部移植后能促進卒中后神經(jīng)功能的修復。在大鼠腦卒中和創(chuàng)傷模型中，經(jīng)靜脈或大腦內(nèi)直接注射MSCs后，MSCs可穿過血腦屏障向損傷腦組織聚集，進而修復神經(jīng)功能。其中，損傷組織似乎可特異吸引MSCs向損傷區(qū)遷移，然而，目前對調(diào)節(jié)MSCs遷移進而向損傷腦組織聚集的機制還不清楚。

2、已知基質(zhì)細胞衍生因子-1α(SDF-1α)和其唯一特異受體CXCR4與干細胞定向遷移和損傷修復密切相關(guān)。在大鼠心肌梗死模型中，SDF-1在促使表達CXCR4的MSCs向缺血心肌的定向遷移、聚集中起很重要作用。而SDF-1α/CXCR4在低氧條件下表達增加，如急性腎衰、缺血性心臟病、腦缺血。為此，推測SDF-1α/CXCR4在MSCs向缺血腦組織的定向遷移中可能也起很重要作用。 RNA干擾(RNAi)技術(shù)可穩(wěn)定沉默哺乳動物細胞內(nèi)的

3、靶向基因，是研究基因功能的強大工具。為探討腦缺血損傷中MSCs的遷移和調(diào)節(jié)機制，我們首先構(gòu)建CXCR4RNAi慢病毒載體，進而建立CXCR4基因穩(wěn)定沉默的大鼠MSCs(rMSCs)。隨后通過體內(nèi)、外實驗研究CXCR4基因沉默和SDF-1α對rMSCs遷移的影響。本課題分三部分。 第一部分：CXCR4基因RNAi慢病毒載體的構(gòu)建及鑒定 1、材料和方法: 1)根據(jù)大鼠CXCR4mRNA序列，選擇三個21nts的靶序列

4、，設(shè)計并合成包含各正、反義靶序列的互補DNA鏈； 2)退火后插入pSUPER載體的H1RNA啟動子后面，產(chǎn)生pRiCXCR4a，b，c； 3)酶切電泳和測序鑒定； 4)質(zhì)粒鑒定正確后，將其中的CXCR4shRNA表達結(jié)構(gòu)酶切，插入到慢病毒載體質(zhì)粒pNL中，產(chǎn)生pNL-RiCXCR4a，b，c。 2、結(jié)果: 1)酶切鑒定和測序都證實pRiCXCR4質(zhì)粒構(gòu)建正確。 2)將pRiCXCR4中的C

5、XCR4shRNA表達結(jié)構(gòu)插入pNL質(zhì)粒，產(chǎn)生能同時表達增強型綠色熒光蛋白(EGFP)和轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生CXCR4shRNA的慢病毒載體質(zhì)粒，測序鑒定正確。 3、結(jié)論: 1)成功構(gòu)建大鼠CXCR4shRNA表達載體pRiCXCR4。 2)成功構(gòu)建大鼠CXCR4基因RNAi慢病毒載體pNL-RiCXCR4。 3)為通過阻斷大鼠CXCR4基因表達進而研究CXCR4功能奠定了基礎(chǔ)。 第二部分：CXCR4基因沉默

6、的骨髓間質(zhì)干細胞的構(gòu)建、培養(yǎng)與鑒定 1、材料和方法: 1)將三質(zhì)粒pNL-RiCXCR4、pHELPER和pVSVG共轉(zhuǎn)染293T細胞，包裝生產(chǎn)慢病毒； 2)經(jīng)超速離心收集病毒顆粒，轉(zhuǎn)導293T細胞，用流式細胞術(shù)測定EGFP蛋白表達率來測定慢病毒功能滴度； 3)用相同滴度的慢病毒轉(zhuǎn)導rMSCs，建立CXCR4基因穩(wěn)定沉默細胞系rMSCs/pNL-R1CXCR4(MSC-CXCR4)； 4)用實時定

7、量RT-PCR、WesternBlot和流式細胞術(shù)檢測CXCR4mRNA、蛋白質(zhì)和細胞表面表達水平，篩選有效的CXCR4基因沉默的細胞系MSC-CXCR4； 5)繪制細胞生長曲線，計算細胞倍增時間，比較CXCR4基因沉默的rMSCs與親本細胞的生長變化。 2、結(jié)果: 1)三質(zhì)粒pNL-R1CXCR4、pHELPER和pVSVG共轉(zhuǎn)染293T細胞，包裝產(chǎn)生慢病毒。 2)未濃縮含病毒細胞培養(yǎng)上清和濃縮病毒懸液

8、的功能滴度分別為6.4×104TU/mL和6.9×106TU/mL。 3)CXCR4基因穩(wěn)定沉默細胞MSC-CXCR4強烈表達EGFP。 4)實時定量RT-PCR、WestemBlot和流式細胞術(shù)一致證實pNL-RiCXCR4b組的CXCR4抑制作用最顯著。 5)親本細胞、非特異細胞和CXCR4基因沉默細胞的生長曲線和倍增時間無明顯差異。 3、結(jié)論: 1)包裝產(chǎn)生高滴度慢病毒，并能高效轉(zhuǎn)導rMSC

9、s。 2)建立CXCR4基因穩(wěn)定沉默細胞系MSC-CXCR4。 3)實時定量RT-PCR分析CXCR4mRNA、WesternBlot檢測CXCR4蛋白和流式細胞術(shù)檢測rMSCs表面CXCR4抗原，均證實所構(gòu)建的慢病毒載體能使rMSCs的CXCR4基因表達顯著下調(diào)。 4)細胞生長曲線測定實驗證明，CXCR4基因沉默rMSCs的生長未受到明顯影響。 第三部分：CXCR4基因沉默及SDF-1α對骨髓間質(zhì)干細胞

10、遷移作用的體內(nèi)、外實驗研究 1、材料和方法: 1)體外實驗在內(nèi)置8μm孔徑聚碳酸酯膜的48孔微遷移板中進行，趨化因子SDF-1α以不同濃度加入到遷移板下室，細胞rMSCs或CXCR4基因沉默的rMSCs加入到上室，觀察細胞遷移情況，計算細胞遷移指數(shù)。 2)取健康成年雄性SD大鼠制作短暫大腦中動脈阻塞(MCAO)模型。在MCAO前24h或MCAO后24h將表達EGFP(EGFP+)的rMSCs經(jīng)股靜脈移植入大鼠體內(nèi)

11、。其中，EGFP+的CXCR4基因沉默的rMSCs僅移植入MCAO后24h的大鼠體內(nèi)。 3)將EGFP陽性(EGFP+)的rMSCs經(jīng)股靜脈移植入正常大鼠體內(nèi)后，立即將SDF-1α直接注射入左側(cè)大腦皮質(zhì)。作為對照，對側(cè)相應(yīng)部位只注射PBS。 4)取大鼠骨髓制作涂片，同時取腦、心、肺、肝、脾、腎、骨骼肌、小腸組織標本制作冰凍切片，在熒光顯微鏡下觀察EGFP+細胞的分布情況。 5)為明確腦組織中SDF-1α表達和EG

12、FP+細胞遷移之間的定位關(guān)系，對腦組織冰凍切片進行SDF-1α的免疫熒光染色。 2、結(jié)果: 1)體外微遷移板實驗表明，加入200ng/mLSDF-1α后可明顯促進rMSCs的跨膜遷移，而rMSCs中CXCR4基因沉默后，rMSCs的跨膜遷移明顯減弱。 2)對MCAO前大鼠或?qū)ξ催M行MCAO的正常大鼠移植EGFP+細胞后，可在其肺、骨髓、脾、小腸發(fā)現(xiàn)EGFP+細胞，而在其他組織未發(fā)現(xiàn)。 3)對MCAO后大鼠

13、移植EGFP+細胞后，發(fā)現(xiàn)大量EGFP+細胞聚集于大腦半球缺血半暗帶區(qū)，在肺中也可見EGFP+細胞分布，在缺血對側(cè)大腦半球及其他組織中未發(fā)現(xiàn)。而rMSCs中CXCR4基因沉默后，這種EGFP+細胞在大腦半球缺血區(qū)的聚集作用被明顯抑制。 4)免疫熒光染色顯示，在腦組織切片中SDF-1α主要由缺血半暗帶區(qū)神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞分泌，EGFP+細胞的數(shù)量和定位與SDF-1α的表達量大體一致。 3、結(jié)論: 1)移植前的腦組