SDF-1-CXCR4軸以及MCP-1-CCR2軸對(duì)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移及歸巢的影響.pdf

1、研究背景和目的
　　缺血性心臟病系威脅人類健康的主要疾病之一，其發(fā)病率仍在不斷上升，仍然是目前臨床上充血性心衰病人的主要病因之一。傳統(tǒng)認(rèn)為心肌細(xì)胞屬于終末期分化細(xì)胞，一旦損傷壞死則不能再生。盡管新近有實(shí)驗(yàn)提出成人心肌細(xì)胞本身可能具有分裂增殖的能力，但其分裂指數(shù)僅為0.03％～0.9％[1-3];也有實(shí)驗(yàn)[4，5]提出心肌中存在的心肌干/祖細(xì)胞（cardiacsterm/progenitorcells，CSCs/CPCs）可以分化為

2、成熟心肌細(xì)胞，但由于其數(shù)量極為有限，不能在心肌梗死后產(chǎn)生足夠的新生心肌取代梗死之心肌，最終心肌梗死病人的梗死心肌纖維化，并絕大部分由疤痕組織替代，喪失心臟作為血泵的收縮功能，纖維化的心肌對(duì)剩余的健康心肌也產(chǎn)生嚴(yán)重影響，隨之而來的心室重構(gòu)進(jìn)一步影響心臟功能，最終發(fā)展為終末期心臟病和充血性心衰。雖然心臟移植是目前治療終末期心臟病病人最為有效的方法，但由于供體心臟來源嚴(yán)重短缺，加上各種免疫抑制劑的副作用給人體帶來的不良影響，嚴(yán)重限制了心臟移植

3、的廣泛開展和應(yīng)用。心臟輔助裝置的應(yīng)用可以使部分病人得到短時(shí)的改善，但常常只能作為等待心臟移植的過渡手段，而不能達(dá)到長(zhǎng)期的治療效果，加上其昂貴的醫(yī)療費(fèi)用，難以在臨床大規(guī)模使用和開展。
　　目前對(duì)缺血性心臟病常用的治療方法包括藥物治療、冠狀動(dòng)脈介入治療和心臟冠狀動(dòng)脈搭橋等方法，均主要集中于改善心肌缺血，而對(duì)壞死心肌沒有任何作用。因此，國(guó)際上一直在探索新的治療方法。已有實(shí)驗(yàn)提示，干細(xì)胞可能分化為心肌細(xì)胞、促進(jìn)梗死區(qū)血管新生，改善心臟功能

4、。胚胎干細(xì)胞由于排斥反應(yīng)及倫理問題，其研究、應(yīng)用受到一定限制;而自體骨髓干細(xì)胞取材簡(jiǎn)單、易于增殖、移植后無免疫排斥反應(yīng)，又不涉及倫理問題，正在成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。研究顯示:骨髓干細(xì)胞具有復(fù)雜性、多能性和遷移性。成年骨髓細(xì)胞包括不同的成熟階段，也包括原始階段的骨髓干細(xì)胞或稱之為多系祖細(xì)胞，以及骨髓基質(zhì)和開始分化的各系定向祖細(xì)胞。骨髓干細(xì)胞沒有一種具體的分化傾向，是一種具有多分化潛能及自我修復(fù)功能的早期未分化細(xì)胞，幾乎可能轉(zhuǎn)化成人體任何組

5、織。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells，MSCs)是其中最具分化潛能的一組細(xì)胞，但MSCs也并非是完全純化的細(xì)胞群體，而是由不同發(fā)育分化潛能的干細(xì)胞組成。近來已發(fā)現(xiàn)較多MSCs表面標(biāo)記，而且不同成熟程度的MSCs表面標(biāo)記并不完全相同，由此可見其復(fù)雜性。
　　骨髓干細(xì)胞治療缺血性心臟病主要涉及到心肌缺血后局部細(xì)胞因子的表達(dá)變化、細(xì)胞因子對(duì)移植或自身干細(xì)胞的趨化歸巢作用以及干細(xì)胞歸巢后的治療作用。可供治療選用的

6、干細(xì)胞有多種亞型，包括造血干細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞、間質(zhì)干細(xì)胞、單個(gè)核細(xì)胞等，各種細(xì)胞亞型有其自身不同的特點(diǎn)。造血干細(xì)胞較其它細(xì)胞數(shù)量多，研究最為深入、透徹，但由于其分化范圍狹窄，只能分化為造血系細(xì)胞，從而使其應(yīng)用受到一定限制;內(nèi)皮祖細(xì)胞可以分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血管新生，從而改善組織血液供應(yīng);間質(zhì)干細(xì)胞具有多種分化潛能，可以分化為治療所需要的各種目標(biāo)細(xì)胞而發(fā)揮治療作用，是很理想的移植細(xì)胞;而骨髓單個(gè)核細(xì)胞由于獲取方便、不需培養(yǎng)、細(xì)胞種類豐

7、富而獲得部分研究者的青睞。但無論選用哪一種細(xì)胞都涉及到一個(gè)中心的問題:歸巢。干細(xì)胞必須歸巢到目標(biāo)區(qū)域才能產(chǎn)生治療作用。歸巢一詞起源于骨髓移植療法的開展，其意義為經(jīng)靜脈輸入的干細(xì)胞通過血液循環(huán)特定地植入到支持其生長(zhǎng)發(fā)育的骨髓微環(huán)境中的過程。隨著研究范圍的擴(kuò)展，目前歸巢的意義已擴(kuò)展為骨髓干細(xì)胞在特定條件的誘導(dǎo)下移行并定位于機(jī)體目標(biāo)組織的過程。
　　心肌梗死后梗死區(qū)域局部產(chǎn)生劇烈的炎癥反應(yīng)，生成多種細(xì)胞因子，包括SDF-1與MCP-1;

8、Ma等[6]研究提示SDF-1于心肌梗死后早期升高，并能通過SDF-1/CXCR4軸促進(jìn)移植的MSCs歸巢到梗死心肌組織中;而Askari等[7]在重建梗死心肌中SDF-1的表達(dá)后，觀察到G-CSF動(dòng)員的骨髓干細(xì)胞歸巢到了梗死心肌中。Lu等[8]研究發(fā)現(xiàn)SD大鼠心肌梗死3d后梗死心肌中MCP-1含量顯著升高，于第7d達(dá)峰值;而Wang等[9]發(fā)現(xiàn)，44.6％的MSCs表達(dá)MCP-1的受體CCR2，并且可通過MCP-1與CCR2的結(jié)合促進(jìn)

9、MSCs歸巢。這些研究均提示SDF-1、MCP-1在促進(jìn)干細(xì)胞歸巢中起到了一定的作用。歸巢后的干細(xì)胞可能分化為心肌樣細(xì)胞或分泌細(xì)胞因子促進(jìn)血管新生、減少心肌細(xì)胞凋亡，從而改善心臟功能。內(nèi)源性SDF-1及MCP-1可能數(shù)量有限，且表達(dá)時(shí)間過短，與心肌梗死后早期劇烈的炎癥反應(yīng)重疊，限制了其促使干細(xì)胞歸巢并改善心臟功能的治療作用;而有關(guān)外源性SDF-1及MCP-1促進(jìn)干細(xì)胞歸巢的研究很少。因此，有必要對(duì)外源性SDF-1及MCP-1在干細(xì)胞歸巢

10、中的作用進(jìn)行研究。而且，多數(shù)研究的結(jié)果提示移植的干細(xì)胞未能歸巢到最需要修復(fù)的梗死中心區(qū)域，而是植入到了梗死周邊區(qū)域。這種現(xiàn)象是否與梗死后心肌不同部位歸巢相關(guān)因子的表達(dá)存在差異有關(guān)尚不明確。MI后隨著時(shí)間的推移，梗死心肌的修復(fù)重構(gòu)也在不斷進(jìn)行，心肌重構(gòu)導(dǎo)致梗死區(qū)變薄、膨出及心臟整體擴(kuò)張，對(duì)心功能產(chǎn)生極為不利的影響。由于我國(guó)經(jīng)濟(jì)基礎(chǔ)差，人民健康意識(shí)淡薄等原因，許多心肌梗死患者，尤其是廣大農(nóng)村的患者，對(duì)缺血性心臟病的認(rèn)識(shí)不足，從而延誤了疾病的

11、治療，使病情不斷進(jìn)展而發(fā)展為終末期心臟病，導(dǎo)致充血性心衰的發(fā)生。干細(xì)胞移植給廣大患者帶來了福音，而MI后應(yīng)該何時(shí)給予干細(xì)胞移植及采用外源性細(xì)胞因子干預(yù)時(shí)究竟應(yīng)該給多少劑量等均有待于進(jìn)一步研究。
　　基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α(Stromalcell-derivedfactor，SDF-1α)屬于CXC族趨化因子成員，是生物體內(nèi)一種關(guān)鍵的細(xì)胞趨化因子。CXCR4(C-X-Cchemokinereceptortype4)是SDF-1α的受

12、體，表達(dá)于多種干/祖細(xì)胞表面，可與SDF-1α耦合介導(dǎo)其遷移。很多研究發(fā)現(xiàn)心肌缺血、血管內(nèi)膜損傷可上調(diào)SDF-1α的表達(dá)，介導(dǎo)多種干細(xì)胞歸巢新生血管、修復(fù)損傷內(nèi)皮。SDF-1α參與心梗后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化調(diào)控，可促進(jìn)血管新生、減小心梗面積。但SDF-1α/CXCR4軸調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞歸巢的作用及機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
　　磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol3-kinase，PI3K)蛋白家族是一種胞內(nèi)

13、磷脂酰肌醇激酶，廣泛表達(dá)于多種組織與細(xì)胞中，參與細(xì)胞遷移、增殖、分化、凋亡、血管生成和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)等多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)。多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)表明，PI3K參與SDF-1α/CXCR4調(diào)控的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞、造血干細(xì)胞等多種干/祖細(xì)胞趨化作用及遷移。但PI3K/Akt的抑制劑wortmannin和ser磷酸化抑制劑LY294002可阻斷這一效應(yīng)，這一結(jié)果表明，PI3K通路在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移、歸巢中發(fā)揮作用。通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，磁珠分選后的間充

14、質(zhì)干細(xì)胞表面表達(dá)有CXCR4/CCR2，它們與趨化因子的相互作用可通過激活PI3K途徑促進(jìn)其他干/祖細(xì)胞遷移、歸巢。本課題觀察CXCR4/CCR2表達(dá)對(duì)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外遷移和體內(nèi)歸巢的影響，同時(shí)探討PI3K通路是否參與CXCR4/CCR2介導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移;采用磁珠分選CXCR4/CCR2陽性細(xì)胞聯(lián)合梗死周邊注射小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，評(píng)價(jià)SDF-1/CXCR4軸和MCP-1/CCR2在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞歸巢及心肌再生

15、中的作用，并探討PI3K通路在其中的作用。
　　本研究成功培養(yǎng)了ICR小鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，建立ICR小鼠心肌梗死模型，分選骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中CXCR4和CCR2表達(dá)陽性的細(xì)胞，研究其歸巢和遷移能力的差異，對(duì)小鼠梗死心肌修復(fù)的影響，并對(duì)PI3K/Akt通路在該歸巢效應(yīng)中的潛在作用進(jìn)行了初步探討。
　　方法:
　　1.無菌條件下取5-8周齡ICR小鼠的脛腓骨，體外全骨髓貼壁法培養(yǎng)，80％鋪滿后進(jìn)行傳代，流式鑒定細(xì)胞表面

16、分子表達(dá)以及細(xì)胞周期，G0/G1期細(xì)胞量較多，CD44、CD90、CD105陽性率較高的細(xì)胞符合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞特征。
　　2.氣管插管輔助3、4肋間開胸結(jié)扎冠狀動(dòng)脈下支的方法建立小鼠心梗模型，檢測(cè)LVEF、FS、LVEDD等指標(biāo)，鑒定小鼠模型是否構(gòu)建成功。
　　3.小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)擴(kuò)增聯(lián)合免疫磁珠分選(MACS)純化CXCR4/CCR2陽性骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并作克隆培養(yǎng)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分選前后的

17、細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)情況。
　　4.采用Transwell模型檢測(cè)CXCR4/CCR2對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移的影響及其可能機(jī)制。下室種植心肌細(xì)胞，上室為純化的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)共分為四組，對(duì)照組，CXCR4+/CCR2+組，CXCR4+/CCR2-組，CXCR4-/CCR2+組，24h后5個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)遷移的細(xì)胞。免疫熒光檢測(cè)下室穿過細(xì)胞。
　　5.左冠脈前降支(LAD)結(jié)扎建立小鼠心梗模型后，在梗死區(qū)周邊選取5個(gè)位點(diǎn)注

18、射分選后的細(xì)胞，觀察移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)體內(nèi)歸巢及對(duì)心梗修復(fù)的影響。實(shí)驗(yàn)共分為7組:假手術(shù)組（sham組）:開胸，不作冠脈前降支（LAD）結(jié)扎也不作干細(xì)胞移植;心梗組（MI組）:結(jié)扎LAD制造心梗，但不作其它處理;PBS對(duì)照組（empty組）:結(jié)扎LAD，梗死周邊區(qū)注射PBS;CXCR4+/CCR2+組:結(jié)扎LAD，梗死周邊區(qū)注射CXCR4+/CCR2+骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，共選5個(gè)位點(diǎn)注射，每次注射30ul，細(xì)胞濃度2×106個(gè)/ml;

19、CXCR4+/CCR2-組:結(jié)扎LAD，梗死周邊區(qū)注射CXCR4+/CCR2-骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，共選5個(gè)位點(diǎn)注射，細(xì)胞數(shù)量同上;CXCR4-/CCR2+組:結(jié)扎LAD，梗死周邊區(qū)注射CXCR4-/CCR2+骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，共選5個(gè)位點(diǎn)注射;CXCR4-/CCR2-組:結(jié)扎LAD，梗死周邊區(qū)注射CXCR4+/CCR2+骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，共選5個(gè)位點(diǎn)注射，3周后檢測(cè)梗死周邊進(jìn)行干細(xì)胞注射的對(duì)照組和細(xì)胞組CM-dil標(biāo)記的間充質(zhì)干細(xì)胞向梗死

20、區(qū)遷移的情況(n=5)。
　　6.歸巢到梗死區(qū)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化情況采用免疫熒光檢測(cè)。檢測(cè)從周邊遷移到梗死區(qū)的CM-dil標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量，每個(gè)心臟標(biāo)本，梗死區(qū)隨機(jī)取10個(gè)高倍視野，計(jì)算CM-DIL陽性細(xì)胞的比例。
　　7.檢測(cè)PI3K/Akt通路在CXCR4/CCR2細(xì)胞遷移過程中的影響。在transwell小室模型中，下室加入MCP-1/SDF-1，LY組細(xì)胞均用LY294002孵育。本實(shí)驗(yàn)分12組:co

21、ntrol組、CXCR4+/CCR2+組、CXCR4+/CCR2-組、CXCR4-/CCR2+組、control(MCP-1/SDF-1)組、CXCR4+/CCR2+(MCP-1/SDF-1)組、CXCR4+/CCR2-(MCP-1/SDF-1)組、CXCR4-/CCR2+(MCP-1/SDF-1)組control(MCP-1/SDF-1、LY)組、CXCR4+/CCR2+(MCP-1/SDF-1、LY)組、CXCR4+/CCR2-(M

22、CP-1/SDF-1、LY)組、CXCR4-/CCR2+（MCP-1/SDF-1、LY）組。WesternBlot檢測(cè)pAkt表達(dá)水平，各組WB條帶的OD值與內(nèi)參組的OD值的比值作為各組的pAkt表達(dá)強(qiáng)度，比較PI3K/Akt通路在CXCR4/CCR2細(xì)胞遷移中所起的作用。
　　結(jié)果:
　　1.全骨髓貼壁法培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成功，CD44/CD90/CD105均高表達(dá)，G0/G1期細(xì)胞率高于70％。
　　2.ICR小

23、鼠心梗模型構(gòu)建成功，與對(duì)照組比較，心梗4周后小鼠左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDd)和左室收縮末期內(nèi)徑(LVEDs)明顯增加(P＜0.05)，左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)和左室短軸縮短指數(shù)(FS)明顯降低(P＜0.05)。二維圖像見心梗模型組左室腔擴(kuò)大，左室前壁出現(xiàn)節(jié)段性運(yùn)動(dòng)減弱、消失及反向運(yùn)動(dòng)等現(xiàn)象;梗死區(qū)局部有心肌強(qiáng)回聲，室壁變薄。
　　3.MACS分選獲得純度較高的CXCR4/CCR2陽性骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，在體外可克隆擴(kuò)增。流式結(jié)果表

24、明，MACS分選前，混合細(xì)胞中CXCR4陽性細(xì)胞比例為31.09±0.35％，經(jīng)c-kit免疫磁珠純化后為86±4.51％，CCR2陽性細(xì)胞比例為16.52±0.76％，經(jīng)c-kit免疫磁珠純化后為56±6.37％，CXCR4/CCR2雙陽性細(xì)胞比例分別為45.62±5.16％，說明磁珠分選干細(xì)胞成功。
　　4.Transwell遷移實(shí)驗(yàn)表明，穿越小室的CXCR4和CCR2表達(dá)陽性的小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量明顯較對(duì)照組多（248.

25、67±9.29vs135.33±11.37，P=0.000＜0.01，n=3）（圖4-4和圖4-5）。而CXCR4表達(dá)陽性的小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量與雙陽性細(xì)胞組比較，明顯少于后者（202.33±9.07vs248.67±9.29，P=0.02＜0.05，n=3）。同樣，CCR2表達(dá)陽性的小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量也明顯少于雙陽性細(xì)胞組（186.33±7.37vs248.67±9.29，P=0.002＜0.01，n=3）。說明通過磁珠分選

26、提高間充質(zhì)干細(xì)胞表面趨化因子受體CXCR4/CCR2的表達(dá)可以促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向靶位的遷移。
　　5.CSCs體內(nèi)歸巢實(shí)驗(yàn)表明，以磁珠分選提高細(xì)胞表面趨化因子受體表達(dá)可以促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向分泌趨化因子的心肌歸巢(CXCR4+/CCR2+vscontrol，226.67±10.97vs123.33±10.26，P=0.003＜0.01，n=3)(圖4-8，圖4-9)。而CXCR4表達(dá)陽性的小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量與雙陽性細(xì)胞

27、組比較，明顯少于后者（199.0±10.54vs226.67±10.97，P=0.02＜0.05，n=3）。同樣，CCR2表達(dá)陽性的小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量也明顯少于雙陽性細(xì)胞組(112.0±14.0vs226.67±10.97，P＜0.01，n=3)，CXCR4陽性組細(xì)胞遷移數(shù)高于CCR2陽性組，且CCR2表達(dá)陽性的小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量與對(duì)照組相比差異不顯著（112.0±14.0vs123.33±10.26，P=0.314＞0.0

28、5，n=3）。體內(nèi)歸巢實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與體外Transwell遷移實(shí)驗(yàn)的結(jié)果是一致的，再一次證實(shí)了磁珠分選獲得表達(dá)不同趨化因子受體的間充質(zhì)干細(xì)胞，因?yàn)镾DF-1表達(dá)水平較高，SDF-1/CXCR4軸對(duì)于間充質(zhì)干細(xì)胞遷移歸巢的影響明顯要強(qiáng)于MCP-1/CCR2軸。
　　6.WB結(jié)果顯示，通過QuantityONE(V)4.6.7軟件以光密度積分值(IOD)對(duì)WesternBlot結(jié)果進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示，下室加入趨化因子后，未分選細(xì)胞、

29、CXCR4+/CCR2+細(xì)胞、CXCR4+/CCR2-細(xì)胞、CXCR4-/CCR2+細(xì)胞的磷酸化Akt表達(dá)水平均上調(diào)，ser位點(diǎn)磷酸化抑制劑LY294002孵育細(xì)胞后pAkt表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　通過磁珠分選獲得的CXCR4/CCR2陽性細(xì)胞注射心梗小鼠心肌，能有效促進(jìn)小鼠心功能改善，縮小梗死面積，其效果優(yōu)于未分選細(xì)胞，且CXCR4/CCR2陽性細(xì)胞的歸巢能力都顯著強(qiáng)于未分選細(xì)胞，其潛