“補(bǔ)腎活血舒筋方”對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移及NF-κB、CXCR4表達(dá)的影響.pdf

1、頸腰痛是骨傷科臨床最常見的疾病，據(jù)統(tǒng)計(jì)80％的人一生中會(huì)為此就診[1]。椎間盤退變(Intervertebral disc degeneration，IVDD)是頸腰痛發(fā)病重要的病理因素，但退變的機(jī)理目前還不十分明確，有關(guān)椎間盤退變的機(jī)理及減緩椎間盤退變的方法是當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。
　　研究目的：
　　由于椎間盤缺乏血管且細(xì)胞數(shù)量少，其本身幾乎不能自我修復(fù)。有研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow derived

2、 mesenchymal stem cells，BMSCs)治療，可以促進(jìn)椎間盤組織的再生。由于BMSCs的來(lái)源有限及植入問(wèn)題，促進(jìn)內(nèi)源性BSMDs歸巢成為一種新的選擇。臨床研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用“補(bǔ)腎活血舒筋方”治療頸腰痛療效顯著，既往實(shí)驗(yàn)證明，“補(bǔ)腎活血舒筋方”可以通過(guò)調(diào)節(jié)核因子(Nuclear factor-κB，NF-κB)抑制炎癥反應(yīng)和椎間盤退變的發(fā)展。因此，我們提出假說(shuō)，“補(bǔ)腎活血舒筋方”通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB/CXCR4促進(jìn)BMSCs

3、歸巢至退變的椎間盤，進(jìn)而修復(fù)退變的椎間盤，達(dá)到治療頸腰痛的目的。本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)觀察“補(bǔ)腎活血舒筋方”對(duì)大鼠BMSCs增殖、遷移及NF-κB、CXCR4表達(dá)的影響，并初步探討B(tài)MSCs遷移的可能機(jī)制。
　　研究方法：
　　取4周齡SPF級(jí)SD大鼠，分離其后肢股骨，采用全骨髓貼壁法分離并提取大鼠BMSCs，放置于含有預(yù)熱的培養(yǎng)基及10％胎牛血清的T25培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，應(yīng)用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。取培養(yǎng)純化至第3代后的BMS

4、Cs分別用成脂和成骨培養(yǎng)基定向誘導(dǎo)分化，并用油紅O及茜素紅染色鑒定分化后的細(xì)胞。制備“補(bǔ)腎活血舒筋方”中藥原液，取20只成年SD大鼠隨機(jī)分成四組，高、中、低中藥血清組分別灌服高、中、低濃度中藥原液，對(duì)照組灌服等體積雙蒸水，制備高、中、低濃度“補(bǔ)腎活血舒筋方”含藥血清及空白血清，采用中藥化學(xué)指紋圖譜對(duì)中藥原液及含藥血清進(jìn)行質(zhì)量控制。將高、中、低濃度“補(bǔ)腎活血舒筋方”含藥血清及空白血清與生長(zhǎng)良好的第3代BMSCs干預(yù)培養(yǎng)24h，應(yīng)用Cell

5、CountingKit-8(CCK-8)法檢測(cè)各組BMSCs的增殖情況。將高、中、低濃度“補(bǔ)腎活血舒筋方”含藥血清及空白血清與生長(zhǎng)良好的第3代BMSCs干預(yù)培養(yǎng)48h，應(yīng)用transwell小室觀察不同濃度含藥血清作用后BMSCs的遷移情況。將高、中、低濃度“補(bǔ)腎活血舒筋方”含藥血清及空白血清與生長(zhǎng)良好的第3代BMSCs干預(yù)培養(yǎng)48h，應(yīng)用Western Bloting檢測(cè)NF-κB、CXCR4蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　

6、1.大鼠BMSCs的形態(tài)學(xué)觀察及鑒定:全骨髓貼壁方法所獲得的BMSCs培養(yǎng)5-7日即可傳代，傳代后增殖速度較原代明顯增快，3d左右可融合達(dá)80％。第3至第5代細(xì)胞純化程度高，細(xì)胞增殖能力強(qiáng);傳代后培養(yǎng)的BMSCs呈紡錘形或多角形，細(xì)胞數(shù)目多、排列緊密時(shí)可呈漩渦狀排列。成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)BMSCs，每三天可觀察到改變，誘導(dǎo)結(jié)束后觀察到細(xì)胞內(nèi)被油紅O染紅的脂滴;成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)BMSCs，每三天可觀察到改變，誘導(dǎo)14天后培養(yǎng)基內(nèi)可

7、見能夠被茜素紅染色的鈣結(jié)節(jié)。
　　2、“補(bǔ)腎活血舒筋方”含藥血清的制備:液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)儀在中藥原液中檢測(cè)到12種有效成分，其中7種入血，血清樣品中以阿魏酸（川芎、當(dāng)歸）、川續(xù)斷皂苷（續(xù)斷）、原兒茶酸（狗脊）含量最高，含藥血清中者三種有效成分含量具有濃度梯度差。
　　3、“補(bǔ)腎活血舒筋方”對(duì)BMSCs增殖及遷移的影響: CCK-8結(jié)果顯示，各濃度含藥血清組細(xì)胞生存率與對(duì)照組有明顯區(qū)別，P＜0.05，但是各濃度

8、含藥血清組之間差異不顯著，P＞0.05。將高、中、低濃度“補(bǔ)腎活血舒筋方”含藥血清及空白血清與BMSCs干預(yù)培養(yǎng)48h后，倒置相差顯微鏡下觀察各組上室下側(cè)均可見細(xì)胞，說(shuō)明BMSCs存在遷移行為。其中，與對(duì)照組比較，低濃度含藥血清組遷移數(shù)目增多，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。中、高濃度含藥血清組遷移細(xì)胞數(shù)目明顯多于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，其中高濃度含藥血清組遷移細(xì)胞數(shù)最多。高、中、低濃度含藥血清組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

9、義(P＜0.05)。
　　4、“補(bǔ)腎活血舒筋方”對(duì)NF-κB、CXCR4蛋白表達(dá)的影響:Western bloting結(jié)果顯示，各實(shí)驗(yàn)組NF-κB、CXCR4蛋白均有表達(dá)，與對(duì)照組比較，高、中、低濃度“補(bǔ)腎活血舒筋方”含藥血組NF-κB、CXCR4蛋白表達(dá)量增高明顯(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。高、中、低濃度含藥血清組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　“補(bǔ)腎活血舒筋方”可促進(jìn)大鼠BMSCs