健脾補(bǔ)腎活血法對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療結(jié)腸炎大鼠干預(yù)的研究.pdf

1、潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerativecolitis，UC)是以腹瀉、黏液膿血便、腹痛和里急后重等為主要癥狀，以結(jié)腸黏膜非特異性炎癥和潰瘍形成為病理特點(diǎn)的一種消化道疾病。因本病治愈難度大，復(fù)發(fā)率高，與結(jié)腸癌的發(fā)病關(guān)系密切，因此被世界衛(wèi)生組織列為現(xiàn)代難治疾病之一。目前的藥物治療主要包括水楊酸類、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制以及手術(shù)治療等，各種治療方法雖可緩解癥狀，但均存在一定的副作用和并發(fā)癥，病情易復(fù)發(fā)，多年遷延不愈，如何提高UC的療效，降低不良反應(yīng)

2、，一直是臨床亟待解決的重要難題。祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，UC屬中醫(yī)的泄瀉、久痢、便血等范疇，實(shí)踐證明，中醫(yī)藥防治UC具有療效確切、不良反應(yīng)少、安全持久的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，值得我們總結(jié)和研究。由于UC主要以結(jié)腸黏膜彌漫性損害(炎癥、糜爛、潰瘍等)為特點(diǎn)，修復(fù)損傷的結(jié)腸黏膜是治愈該病的關(guān)鍵。腸道黏膜上皮細(xì)胞終身不斷自我更新以維持其動(dòng)態(tài)平衡，而這種動(dòng)態(tài)平衡需要干細(xì)胞來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、衰老及凋亡，由此可見腸道干細(xì)胞在維持腸道結(jié)構(gòu)與功能的完整以及損傷后的修復(fù)中扮演著

3、重要角色。本研究將在中醫(yī)理論指導(dǎo)下，運(yùn)用細(xì)胞及分子生物學(xué)技術(shù)和方法，比較及篩選不同中醫(yī)治法(健脾、補(bǔ)腎、活血)干預(yù)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells，MSCs)修復(fù)UC結(jié)腸黏膜的作用，為進(jìn)一步挖掘中醫(yī)藥臨床治療的有效方藥奠定基礎(chǔ)。 目的： 探討MSCs在治療UC中的作用，MSCs移植在結(jié)腸炎大鼠腸道的定位分化及不同中醫(yī)治法的影響，比較及篩選中醫(yī)藥的有效治法。 方法： 按照隨機(jī)分組的

4、原則，雌性SD大鼠分為正常組、模型對(duì)照組、MSCs移植組、參苓白術(shù)散組、金匱腎氣丸組、桃紅四物湯組，每組20只。另設(shè)一組同種系雄性SD大鼠20只作為MSCs體外培養(yǎng)來(lái)源，用免疫細(xì)胞化學(xué)方法鑒定其MSCs表型。動(dòng)物造模，除正常組外，其余各組大鼠造模前禁食不禁水48h，禁食24h后以氯氨酮(100mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，用硅膠管插入大鼠肛內(nèi)約8cm，經(jīng)管內(nèi)注入5％2、4、6，三硝基苯磺酸(TNBs)水溶液0.4ml(100mg/kg)

5、加入50％乙醇0.25ml，約10s灌注完畢。造模后第二天將體外分離培養(yǎng)的雄性大鼠MSCs(2×106/ml個(gè)MSCs的懸浮液約0.4ml)經(jīng)尾靜脈注射到雌性大鼠體內(nèi)，分別給予不同中藥灌胃，按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及人的體表面積比例換算，參苓白術(shù)散組劑量為30g/kg/只，金匱腎氣丸組大鼠藥物劑量為16g/kg/只，桃紅四物湯組劑量為12g/kg/只，均為每日1次，連續(xù)15天。療程結(jié)束后，取大鼠結(jié)腸組織，PCR擴(kuò)增其MSCsY染色體的性別決定區(qū)段s

6、ry后凝膠電泳法檢測(cè)，免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)其腸道干細(xì)胞標(biāo)記物Musashi-1、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)，以及增殖細(xì)胞核抗原(proliferatingcellnuclearantigen，PCNA)的表達(dá)，觀察不同中醫(yī)治法代表方藥對(duì)MSCs在結(jié)腸炎大鼠腸道定植分化及細(xì)胞增殖作用的影響。 結(jié)果： (1)體外分離培養(yǎng)的雄性SD大鼠MSCs表型鑒定顯示CD44表達(dá)陽(yáng)性，CD34表達(dá)陰性，符合MSCs特異性表型特征；大鼠UC

7、造模后，與正常組比較，各組大鼠腸黏膜損傷指數(shù)明顯升高，表明造模成功。 (2)經(jīng)過(guò)中藥灌胃治療后，與模型對(duì)照組比較，MSCs移植組及中藥治療各組腸黏膜損傷指數(shù)均有減低，其中桃紅四物湯組較明顯降低黏膜損傷指數(shù)(P＜0.05)。 (3)經(jīng)PCR擴(kuò)增后，凝膠電泳可以檢測(cè)到結(jié)腸組織雄性性別特異性基因區(qū)段sry，MSCs移植組陽(yáng)性率為20％，參苓白術(shù)散組陽(yáng)性率為25％，金匱腎氣丸組陽(yáng)性率為25％，桃紅四物湯組陽(yáng)性率為35％。

8、 (4)免疫組化檢測(cè)到MSCs移植組及中藥治療各組大鼠結(jié)腸黏膜組織Musashi-1及TERT均有陽(yáng)性表達(dá)，PCNA的表達(dá)有不同程度增強(qiáng)，其中桃紅四物湯組與MSCs移植組比較差異有顯著性意義(P＜0.05)。 結(jié)論： MSCs移植于結(jié)腸炎大鼠后，隨血循環(huán)到達(dá)結(jié)腸定位及分化，且可增強(qiáng)腸上皮細(xì)胞的再生。中醫(yī)健脾、補(bǔ)腎、活血法中藥對(duì)其有一定的促進(jìn)作用，其中活血法代表方藥桃紅四物湯較明顯促進(jìn)MSCs在結(jié)腸炎大鼠腸道定植、分化，以