骨髓間充質干細胞移植治療潰瘍性結腸炎的實驗研究.pdf

1、目的： 潰瘍性結腸炎(Ulcerativecolitis，UC)是一種原因不明的慢性非特異性結腸炎。其病情易復發(fā)，遷延不愈，可致嚴重并發(fā)癥，已成為臨床治療的一個難題。本病在歐美等國家常見，近年來我國該病的發(fā)病率有明顯增高趨勢。其確切的病因和發(fā)病機制至今尚不清楚，認為與免疫系統(tǒng)失常、遺傳易感性、環(huán)境及精神等多種因素密切相關。UC的治療方法有多種，但均療效不太令人滿意。國外有應用干細胞移植治療UC的個案報道，但尚缺乏系統(tǒng)的實驗研究。

2、本文旨在通過將同種異體大鼠骨髓間充質干細胞(Mesenchymalstemcells，MSCs)移植入大鼠UC模型后，探討MSCs在大鼠UC模型結腸的定位情況；探討移植后大鼠UC模型血清中的TNF-α、IL-10含量的變化。從動物實驗角度探討MSCs移植治療UC的可行性。 材料與方法： 實驗對象選擇健康雌性的SD大鼠，約8周齡，體重約180-200g。隨機分為A組為UC模型移植組，B組為UC模型對照組，C組為酒精對照組。

3、A、B組均采用三硝基苯磺酸(TNBS)與酒精復合灌腸法建立UC模型，C組用酒精灌腸作為對照。用貼壁法以PBS-LDMEM培養(yǎng)基體外連續(xù)傳代培養(yǎng)獲得雄性SD大鼠的MSCs。A組造模后24小時，將0.4ml含2×106個MSCs的細胞懸浮液經尾靜脈注射于UC模型的大鼠體內，同時B、C兩組亦于灌腸后24小時注射0.4ml的生理鹽水作為對照。分別于移植后第1天、第7天、第21天每組各取6、6、4只大鼠，手術切取遠端結腸組織，用于制作病理切片(H

4、-E染色)以觀察其形態(tài)學變化，以及用于檢測髓過氧化物酶(MPO)及提取DNA進行sry區(qū)段的檢測。后者經PCR方法檢測Y染色體的性別決定區(qū)段(sry)作為定位的標志，以確定MSCs的腸道定位情況。組織中的髓過氧化物酶活性用二甲氧基聯苯胺-過氧化氫法檢測。同時，經腹主動脈無菌采血，提取血清，用于檢測血清中細胞因子IL-10和TNF-α的含量，以觀察炎癥因子的變化情況。 結果： 骨髓間充質干細胞于培養(yǎng)后24小時內貼壁，5～6

5、天后，貼壁細胞體積增大呈梭形，有粗大突起伸出，部分細胞呈多角形，除部分細胞單個散在外，細胞多數聚集成集落；10～12天左右細胞鋪成單層，排列成旋渦狀，呈梭形或多角形，傳代3次后即可移植。計數50mL體積培養(yǎng)瓶中細胞數目可達5×106個/瓶。經流式細胞儀檢測CD44陽性率為89.58％，CD54陽性率為95.54％。 大鼠UC模型病理學上可見結腸粘膜的毛細血管擴張、充血、水腫，大量的淋巴細胞和中性粒細胞浸潤。粘膜上皮細胞間有中性粒

6、細胞浸潤，腺體呈環(huán)狀，腺細胞減少或消失，有隱窩膿腫及潰瘍形成等一系列類似人UC的病理變化。A、B組的髓過氧化物酶(MPO)于第1天(A組：3.57±0.39，B組：3.33±0.56)、第7天(A組：2.38±0.59，B組：2.18±0.67)均較C組(第1天：1.15±0.39，第7天：0.84±0.40)明顯升高(p＜.05)。在B組，與第1天(3.33±0.56)相比，第7天(2.18±0.67)和第21天(1.49±0.39)

7、顯著增高(p＜0.05)，而第7天、第21天之間無顯著差異(P＞0.05)表明A、B兩組炎癥明顯，并于第7天炎癥達高峰，隨后降低。 移植后sry檢測顯示：第1天，第7天和第21天陽性率分別為0％(0/6)，16.7％(1/6)和50.0％(3/6)，而對照組均陰性。 A、B組血清TNF-α(A組：52.8±16.7，B組：53.6±10.5)與IL-10含量(A組：161.6±23.0，B組：153.6±12.8)于第1

8、天均較C組(C組TNF-α：28.6±7.8，IL-10：112.7±30.9)升高(p＜0.05)，但第7天(A組TNF-α：26.4±17.0，IL-10：133.7±10.3;B組TNF-α：36.8±12.7，IL-10：133.4±6.1)，第21天時(A組TNF-α：25.5±8.8，IL-10：133.7±13.2;B組TNF-α36.5±14.8，IL-10：128.9±31.2)均與C組(第7天TNF-α：30.4±1

9、0.2，IL-10：131.0±10.3;第21天TNF-α：31.3±9.4，IL-10：140.6±7.6)無差異(P＞0.05)，且A、B兩組在各時期比較均無明顯差異(P＞0.05)。 結論： 1.潰瘍性結腸炎大鼠模型血清中TNF-α的水平和IL-10的水平均于炎癥早期明顯升高。2.同種異體大鼠骨髓間充質干細胞移植后其能在潰瘍性結腸炎大鼠模型的腸道中定位。 3.骨髓間充質干細胞移植后潰瘍性結腸炎大鼠模型血清