靜脈移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸的分布.pdf

1、目的：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能[1],在機(jī)體組織損傷修復(fù)過(guò)程及細(xì)胞移植治療等多個(gè)領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。隨著B(niǎo)MSCs用于組織修復(fù)和基因治療的研究,體內(nèi)以及體外培養(yǎng)擴(kuò)增的BMSC的定向募集遷移潛能引起人們的關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)將分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增、熒光標(biāo)記大鼠BMSCs,經(jīng)靜脈移植入潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,U

2、C)模型大鼠,擬探討移植細(xì)胞濃度、以及硝普鈉對(duì)BMSCs歸巢到結(jié)腸的影響。為BMSCs在消化管組織工程以及腸黏膜損傷性疾病治療研究中的應(yīng)用,提供基礎(chǔ)理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 第一部分骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性
　　 1.取4-6w SD大鼠骨髓細(xì)胞,分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增獲取BMSCs。流式細(xì)胞儀檢測(cè)第3和第5代(P3和P5)BMSCs的免疫表型。結(jié)果:分離、培養(yǎng)原代細(xì)胞3～12d,細(xì)胞數(shù)量迅速增多,具有典型的長(zhǎng)梭狀的形態(tài)及漩

3、渦狀排列的特征。流式細(xì)胞儀分析P3和P5細(xì)胞表面標(biāo)記物CD44、CD90為陽(yáng)性,CD45為陰性。表達(dá)CD44、CD90的均一性分別為98.26±0.48％及98.68±0.32％。
　　 2.取P3大鼠BMSCs用1μmoL/L的地塞米松、0.5 mmoL/L的3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、10 mg/L的胰島素、100mmoL/L的吲哚美辛(indomethncin)和10％FBS的H-DMEM誘導(dǎo)培養(yǎng)。誘導(dǎo)第3d起光鏡下可見(jiàn)細(xì)

4、胞變?yōu)閳A形或橢圓形,胞質(zhì)有脂滴。誘導(dǎo)第10d,油紅O染色脂滴呈橘紅色;對(duì)照組仍為長(zhǎng)梭形,無(wú)脂滴出現(xiàn)。另用含地塞米松0.1μmol/L、β-甘油磷酸鈉10mmol/L、維生素C 50mg/L和10％FBS的L-DMEM的條件培養(yǎng)液定向誘導(dǎo)P3細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。從誘導(dǎo)第2d開(kāi)始,部分細(xì)胞由長(zhǎng)梭形逐漸變?yōu)榱⒎叫?進(jìn)而轉(zhuǎn)變?yōu)槎嘟切?培養(yǎng)第8d時(shí),大多數(shù)細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槎嘟切?19d左右出現(xiàn)鈣化結(jié)節(jié),茜素紅染色呈橘紅色;對(duì)照組細(xì)胞仍為長(zhǎng)梭形,未見(jiàn)鈣結(jié)

5、節(jié)形成。
　　 第二部分靜脈移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸的分布
　　 1. SD大鼠30只隨機(jī)分為A、B、C組,以免疫+TNBS/乙醇復(fù)合法建立UC模型。制備DAPI熒光標(biāo)記的P3～P5-BMSCs懸液備用。模型制備完成后24 h內(nèi),3組大鼠均經(jīng)尾靜脈注射1mL分別含1×106、5×106、1×107的DAPI標(biāo)記的BMSCs。移植后第7、14 d各處死5只大鼠,取結(jié)腸做恒冷切片,熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)各組DAP

6、I標(biāo)記BMSCs在潰瘍部位和正常部位的細(xì)胞數(shù)。相同切片再經(jīng)HE染色,觀(guān)察形態(tài)。結(jié)果:移植后第7、14 d,各組大鼠結(jié)腸均見(jiàn)藍(lán)色熒光標(biāo)記的BMSCs,主要分布于黏膜層及黏膜下層,偶見(jiàn)于肌層及外膜。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示:移植第7、14 d各組潰瘍部位陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯高于正常部位陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(F=65.17,P0.01);移植第7d,B組潰瘍及正常部位的細(xì)胞數(shù)均高于A(yíng)組(F=13.06,P 0.05),B組與C組差異不顯著。
　　 2. SD大鼠

7、20只隨機(jī)分為D、E組,同樣方法建立UC模型。制備DAPI熒光標(biāo)記的P3～P5 BMSCs懸液備用。模型制備完成后24 h內(nèi),2組大鼠均經(jīng)尾靜脈注射1mL含5×106熒光標(biāo)記的BMSCs懸液,E組同時(shí)加入含0.2mg/kg體重的硝普鈉。移植后第7、14 d每組各處死5只大鼠,取結(jié)腸觀(guān)察計(jì)數(shù)各組DAPI標(biāo)記BMSCs在結(jié)腸潰瘍部位和正常部位的細(xì)胞數(shù)。相同切片再經(jīng)HE染色,觀(guān)察形態(tài)。結(jié)果:移植后第7、14 d,熒光標(biāo)記的BMSCs在D、E組

8、UC大鼠結(jié)腸的主要分布同A、B、C組。移植第7、14 d各組潰瘍部位陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯高于正常部位陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(F=354.54,P 0.01);移植第7 d,E組潰瘍處的細(xì)胞數(shù)均高于D組(F=15.00,P 0.05);第7d和14d,E組正常部位的細(xì)胞數(shù)均高于D組(F=23.12,P 0.05)。
　　 全文結(jié)論：
　　 1.用貼壁篩選法,成功分離得到大鼠BMSCs,流式細(xì)胞儀分析培養(yǎng)的P3、P5-BMSCs具有MSCs的

9、表面標(biāo)記特征。
　　 2.所獲P3-BMSCs在體外可誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞或者脂肪細(xì)胞,證明所分離的BMSCs具有多向分化的能力。
　　 3.移植第7、14 d,各組結(jié)腸潰瘍部位熒光標(biāo)記的BMSCs細(xì)胞數(shù)明顯高于非病變部位,這提示病損的組織和器官對(duì)BMSCs可能有特異的趨化作用。
　　 4. 3種劑量BMSCs經(jīng)靜脈移植入U(xiǎn)C大鼠后在其結(jié)腸分布的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,并非移植細(xì)胞數(shù)量越多,遷移到結(jié)腸損傷部位的細(xì)胞就越多,最