骨橋蛋白對骨髓間充質(zhì)干細胞定向遷移的影響及其分子機理.pdf

1、骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymalstemcells,MSCs)具有多向分化潛能。在不同培養(yǎng)條件下，MSCs能分化成為多種細胞。越來越多的證據(jù)表明，MSCs具有廣闊的臨床應用前景。除了易于分離獲取、體外增殖潛力巨大和不涉及倫理問題這些優(yōu)勢外，MSCs還具有趨化特性。趨向受損部位的定向遷移已經(jīng)成為MSCs臨床應用研究的關(guān)鍵問題。
　　骨橋蛋白(osteopontin,OPN)是一種細胞外基質(zhì)蛋白，在不同的組織細胞中均有所發(fā)現(xiàn)。

2、當機體各部位受到損傷時，損傷部位的OPN表達升高。OPN表達的升高不僅能增加多種細胞的遷移能力，同時也能介導細胞定向遷移。
　　迄今為止，OPN在MSCs定向遷移過程中的作用還未引起研究者的足夠重視，相關(guān)的研究還鮮見報道，其分子機理更不明了。因此，本文試圖揭示外源OPN在大鼠MSCs(ratMSCs,rMSCs)定向遷移過程中的作用及其分子機理。該研究工作的主要內(nèi)容及結(jié)果如下：
　　1.rMSCs的原代分離培養(yǎng)及鑒定

3、　　利用1.073g/ml的Percoll密度梯度離心法和rMSCs貼壁特性，體外分離培養(yǎng)rMSCs。結(jié)果表明，原代細胞14天左右達到85％融合。傳代后的細胞貼壁時間約為半小時。細胞24h內(nèi)即可完全伸展，呈纖維狀。傳代細胞增殖能力強，4~6天達到80%~90%融合，并形成漩渦樣單層，細胞形態(tài)趨于一致。流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，分離得到的細胞表達CD44和CD90，但不表達CD34，符合MSCs表面標記抗原的一般規(guī)律。
　　2.OPN促r

4、MSCs定向遷移
　　Transwell遷移實驗檢測OPN是否能夠誘導rMSCs定向遷移。結(jié)果表明，OPN具有促rMSCs定向遷移的能力，并且OPN促rMSCs定向遷移的能力與OPN的濃度呈現(xiàn)一定的劑量相關(guān)性。
　　3.Integrinβ1介導OPN促rMSCs遷移
　　為檢測在遷移過程中，OPN是否能改變細胞CD44v6或integrinβ1mRNA的表達，RT-PCR檢測OPN(1μg/ml)作用rMSCs后，mR

5、NA的表達變化情況。結(jié)果表明，OPN能使integrinβ1mRNA的表達水平增加(1.5倍，p<0.01)。但CD44v6mRNA的表達情況卻沒有明顯改變。另外，western蛋白印跡表明，OPN作用2.0h以后，integrinβ1的蛋白表達開始上升；4.0h，達到峰值(1.3倍，p<0.05)；6.0h以后，integrinβ1的蛋白表達開始下調(diào)，但依舊高于對照組。阻斷integrinβ1受體后，OPN促rMSCs定向遷移的能力受

6、到抑制。提示，OPN能夠增加rMSCs中integrinβ1的表達，同時通過結(jié)合細胞表面integrinβ1受體，促進rMSCs定向遷移。
　　4.黏著斑激酶(focaladhesionkinase,FAK)/胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellularsignalregulatedkinase,ERK)信號通路介導OPN促rMSCs定向遷移
　　Western蛋白印跡檢測OPN(1μg/ml)作用rMSCs后，磷酸化FAK

7、(phospho-FAK,pFAK)和磷酸化ERK1/2(phospho-ERK1/2,pERK1/2)的表達變化情況。結(jié)果表明，OPN作用條件下0.5h，pFAK的表達量升高(1.3倍，p<0.05)，F(xiàn)AK信號通路被激活；pERK1/2在OPN作用0.5h時，表達升高(1.7倍，p<0.05)，1.0h，達到峰值(2.8倍，p<0.01)，2.0h有所回落(1.3倍，p<0.05)，4.0h后與對照組相比沒差異。抑制劑阻斷OPN激活

8、ERK和FAK信號通路以后，OPN促rMSCs定向遷移的能力受到抑制。另外，integrinβ1抗體可有效抑制OPN升高pFAK和pERK1/2表達的作用，阻斷FAK/ERK信號通路的激活。提示，OPN結(jié)合integrinβ1受體以后，通過激活FAK/ERK信號通路，促進rMSCs定向遷移。
　　5.OPN改變rMSCs的力學性質(zhì)
　　原子力顯微鏡(atomicforcemicroscope,AFM)檢測OPN(1μg/ml

9、)作用后，rMSCs楊氏模量的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OPN可以顯著降低rMSCs的楊氏模量(p<0.05)。另外，阻斷integrinβ1受體，抑或阻斷FAK/ERK信號分子的激活均能抑制OPN降低細胞楊氏模量的作用。結(jié)果表明，rMSCs的遷移能力與其細胞硬度密切相關(guān)。
　　本文的研究結(jié)果表明，OPN可以通過上調(diào)integrinβ1的表達，激活FAK/ERK信號通路，降低rMSCs的細胞硬度，從而促進rMSCs定向遷移。結(jié)果提示，機體受