Dvl調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞向HGF的定向遷移.pdf

1、間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells, MSCs）是一種間質(zhì)組織細(xì)胞，可以從不同的組織中分離得到如骨髓、骨骼肌、脂肪、臍帶、循環(huán)系統(tǒng)、牙髓和羊水等，具有自我更新和多向分化的潛能，可誘導(dǎo)分化成骨、軟骨、肌、脂肪和神經(jīng)等多種細(xì)胞，在大鼠腦缺血區(qū)域或脊髓損傷區(qū)域移植MSCs能夠促進(jìn)其向損傷部位遷移并行使其修復(fù)功能。為了保證移植的MSCs由移植部位遷移到受損部位，且要保證遷移到損傷部位的細(xì)胞數(shù)量，這就需要研究調(diào)控細(xì)胞定向遷

2、移的分子機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)HGF能夠通過(guò)結(jié)合其受體c-met使β-catenin入核，從而激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞的遷移。而Dvl作為該信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白，參與調(diào)節(jié)HGF所誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞的侵襲，本實(shí)驗(yàn)旨在研究Dvl對(duì)HGF誘導(dǎo)的MSCs定向遷移的作用機(jī)制。
　　采用全骨髓法從SD大鼠骨髓中成功分離并在體外培養(yǎng)出高純度的MSCs。用P3代以上細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料，提取MSCs的總RNA，RT-PCR克隆得到SD大鼠的D

3、vl以及其結(jié)構(gòu)缺失突變體ΔDIX和ΔDEP的cDNA，利用AdEasyTM系統(tǒng)構(gòu)建重組腺病毒載體Ad-Dvl、Ad-ΔDIX和Ad-ΔDEP。構(gòu)建成功的重組腺病毒在QBI-293A細(xì)胞中包裝以及擴(kuò)增，獲得高滴度的病毒子，感染細(xì)胞以獲得高表達(dá)Dvl、DIX和DEP的MSCs。同時(shí)針對(duì)SD大鼠Dvl基因由Abgent公司設(shè)計(jì)并合成FAM熒光標(biāo)記的siRNA：FAM-siRNA，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染MSCs降低Dvl的表達(dá)。為進(jìn)一步檢測(cè)Dvl在MSC

4、s的定向遷移過(guò)程中的作用提供有利的工具。
　　首先研究Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)MSCs遷移行為的影響。通過(guò)使用抑制劑DKK1和FH535以及激活劑LiCl和Wnt3a改變Wnt/β-catenin信號(hào)通路，采用Boyden chamber與Dunn chamber裝置研究表明激活劑LiCl和Wnt3a促進(jìn)了MSCs遷移，而抑制劑FH535降低MSCs的遷移能力，并能夠阻遏Wnt3a和LiCl對(duì)細(xì)胞遷移的促進(jìn)作用。Wes

5、tern blot表明Wnt3a和LiCl促進(jìn)β-catenin的累積，而FH535能夠抑制這一效應(yīng)，說(shuō)明激活的Wnt/β-catenin信號(hào)通路能夠通過(guò)上調(diào)β-catenin調(diào)控MSCs遷移，但卻發(fā)現(xiàn)抑制劑DKK1促進(jìn)了MSCs的遷移，并略微增強(qiáng)Wnt3a促進(jìn)的細(xì)胞遷移能力。據(jù)報(bào)道DKK1通過(guò)JNK調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移，故此利用JNK的特異性抑制劑SP600125處理細(xì)胞，結(jié)果顯示SP600125抑制DKK1對(duì)MSCs遷移的促進(jìn)作用，同時(shí)發(fā)現(xiàn)

6、DKK1能夠增加JNK的磷酸化，這說(shuō)明DKK1可能通過(guò)JNK介導(dǎo)的非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路調(diào)節(jié)MSCs的遷移。
　　為了證明Dvl在MSCs的定向遷移過(guò)程中的作用，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR從mRNA水平檢測(cè)MSCs中Dvl三種亞型的相對(duì)表達(dá)情況，數(shù)據(jù)顯示MSCs中Dvl的三種亞型均表達(dá)，但是相對(duì)表達(dá)量不同，Dvl2表達(dá)量最高，Dvl1和Dvl3的表達(dá)量相對(duì)較低，僅僅占總Dvl表達(dá)量的10%。用Wnt3a、DKK1以及HGF處理后，Dvl

7、三個(gè)亞型在mRNA水平上有較小的變化，這說(shuō)明Wnt3a、DKK1以及HGF調(diào)節(jié)Dvl并不是在mRNA水平發(fā)揮作用的，可能是在蛋白水平或Dvl在胞內(nèi)不同分布來(lái)發(fā)揮其生物學(xué)功能。
　　最后利用siRNA降低MSCs中Dvl的表達(dá)以及Ad-Dvl感染MSCs高表達(dá)Dvl，通過(guò)改變MSCs中Dvl的水平，利用Dunn chamber和Boyden chamber裝置檢測(cè)MSCs的遷移變化，結(jié)果顯示siRNA抑制了MSCs的遷移，并減弱MS

8、Cs向Wnt3a以及HGF定向遷移的能力，而高表達(dá)Dvl能夠促進(jìn)MSCs的遷移，并增強(qiáng)Wnt3a以及HGF對(duì)細(xì)胞遷移的趨化作用。為了進(jìn)一步闡明Dvl對(duì)MSCs定向遷移的作用，利用Ad-ΔDIX和Ad-ΔDEP感染MSCs數(shù)據(jù)顯示Ad-ΔDIX能夠抑制Wnt3a以及HGF誘導(dǎo)的MSCs的定向遷移，但Ad-ΔDEP沒(méi)有顯著變化。Western bolt檢測(cè)結(jié)果表明Ad-Dvl、Ad-ΔDEP能夠增加β-catenin的表達(dá)，Ad-ΔDIX沒(méi)

9、有此效果，這說(shuō)明Dvl通過(guò)DIX結(jié)構(gòu)域激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路調(diào)節(jié)MSCs的定向遷移。但Ad-ΔDEP降低了DKK1促進(jìn)MSCs遷移的能力，而且DEP結(jié)構(gòu)域調(diào)節(jié)JNK磷酸化。
　　綜上，Dvl通過(guò)上調(diào)β-catenin促進(jìn)MSCs向Wnt3a以及HGF的定向遷移，當(dāng)降低Dvl表達(dá)能夠抑制Wnt3a以及HGF促進(jìn)的MSCs定向遷移能力，而高表達(dá)Dvl通過(guò)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路增強(qiáng)Wnt3a以及HGF誘導(dǎo)