骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向膠質(zhì)瘤遷移的機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　 惡性膠質(zhì)瘤的外科治療中困擾人們的問題足腫瘤殘留、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移病灶、衛(wèi)星病灶切除困難,亞臨床病灶難以發(fā)現(xiàn)等等。因此在外科手術(shù)的基礎(chǔ)上,針對(duì)惡性膠質(zhì)瘤的放療、化療及生物、基因治療等輔助治療的重要性已為人們所共識(shí)。靶向治療具有效果確切,損傷小的特點(diǎn),但是合適的載體很重要,尋找合適的基因治療載體變得很迫切。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是存在于骨髓中的非造血細(xì)胞,具有多向分化潛能和定向遷移能力?？烧T導(dǎo)分化為骨、軟骨細(xì)胞、脂肪

2、細(xì)胞、肌腱、肌肉細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等多種細(xì)胞。特別是,骨髓細(xì)胞具有向腫瘤的趨化特性,有可能成為理想的基因治療載體。BMSCs定向遷移的機(jī)制尚不明確。目前普遍接受的是腫瘤細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子和BMNCs表面表達(dá)的受體間的相互作用是促進(jìn)其趨化遷移的動(dòng)力。闡明BMSC遷移的機(jī)制,有助于提高向腫瘤遷移的效率,可以提高基因靶向治療的效果,同時(shí)有利于解釋腫瘤形成的機(jī)制。血管細(xì)胞粘附分子-1(VCAM-1)是一類重要的細(xì)胞表面粘附分子。它參與調(diào)節(jié)白細(xì)胞向微

3、血管內(nèi)皮的遷移及附著。研究表明VCAM-1在BMSC向心血管內(nèi)皮的遷移中發(fā)揮作用。而VCAM-1在BMSCs向膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移中具有何種作用目前尚無報(bào)道。前期研究發(fā)現(xiàn),血小板衍生生長因子-BB(PDGF-BB)是較強(qiáng)烈吸引BMSCs遷移的因子。分析VCAM-1以及PDGF-BB在BMSC趨化遷移中的作用有助于提高其作為基因靶向治療的載體的效率。
　　 本研究首先建立大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)體系,并進(jìn)行相關(guān)的表面標(biāo)志物鑒定。

4、同時(shí)利用體外遷移模型探討大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向膠質(zhì)瘤細(xì)胞條件培養(yǎng)基的趨化遷移能力。在這一過程中,分析VCAM-1在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的表達(dá)情況以及膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)其表達(dá)的調(diào)控。然后利用特異性阻斷抗體研究VCAM-1在髓間充質(zhì)干細(xì)胞向膠質(zhì)瘤的遷移中的作用。然后利用不同濃度的PDGF-BB對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行孵育,觀察VCAM-1的表達(dá)變化并探討P38,PI3K等信號(hào)傳導(dǎo)通路在這一過程中的作用。
　　 材料和方法:
　　 一、骨

5、髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)鑒定及向膠質(zhì)瘤細(xì)胞條件培養(yǎng)基的趨化
　　 (一)實(shí)驗(yàn)材料
　　 1、主要試劑:
　　 L-DMEM低糖培養(yǎng)基,胎牛血清,兔抗大鼠CD34、CD44、CD54、CD105多克隆抗體。小鼠抗大鼠CD45多克隆抗體。DAB酶底物顯色試劑盒。75cm2培養(yǎng)瓶(Corning)。主要耗材為Transwell小室(聚碳酸酯膜,孔徑為8um,型號(hào)3422,ComingCostar公司)。
　　

6、2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
　　 健康雌性SD大鼠,4-6周齡,體重60.809,BMSCs培養(yǎng)原代取材使用,由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供。
　　 3、主要儀器
　　 二氧化碳培養(yǎng)箱,倒置顯微鏡,酶標(biāo)光度儀,精密PH計(jì),電子天平,臺(tái)式離心機(jī)及超凈工作臺(tái)。75cm2培養(yǎng)瓶。Transwell小室。
　　 (二)實(shí)驗(yàn)方法
　　 1、BMSC的原代取材及全骨髓貼壁法進(jìn)行培養(yǎng)。
　　 2、利用免疫組化及流式細(xì)胞

7、技術(shù)鑒定BMsCs的表面標(biāo)志物CD34,CD45,CD44,CD105及CD54,CD90及CD73。
　　 3、培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞并制備條件培養(yǎng)基。
　　 4、利用Transwell建立骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外遷移模型。
　　 二、血管細(xì)胞粘附分子-1在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)及其對(duì)遷移的作用
　　 (一)實(shí)驗(yàn)材料
　　 1、主要試劑:
　　 兔抗大鼠VCAM-1多兜隆抗,LY294002,Tr

8、izol,RNAPCRKit(AMV)ver3.0,羅丹明標(biāo)記的山羊抗兔熒光二抗,RIPA裂解液,小鼠抗大鼠β-actin一抗及二抗。
　　 2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
　　 健康雌性SD大鼠,4-6周齡,體重60.809,BMSCs培養(yǎng)原代取材使用,由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供。
　　 (二)實(shí)驗(yàn)辦法
　　 1、免疫組織化學(xué)及免疫熒光鑒定VCAM-1在BMSCs的表達(dá)。
　　 2、C6及U87條件培養(yǎng)基孵育B

9、MSC24小時(shí),免疫熒光、RT-PCR及westernblot測(cè)定VCAM-1表達(dá)的改變。
　　 3、Transwell體外遷移模型評(píng)估阻斷VCAM-1后BMSC遷移變化。
　　 4、免疫熒光、RT-PCR及westernblot測(cè)定LY294002對(duì)BMSC的VCAM-1表達(dá)的影響。
　　 三、血小板衍生生長因子-BB對(duì)BMSC的VCAM-1的表達(dá)調(diào)控
　　 (一)實(shí)驗(yàn)材料
　　 1、主要試劑:

10、
　　 重組PDGF-BB,抑制劑為SB203850,LY294002,SP600125,PD98059及BAY11-7082。兔抗大鼠VCAM-1多克隆抗體,TRizol(Invitrogen)。RNAPCRKit(AMV)ver3.0(Takara)。
　　 2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
　　 健康雌性SD大鼠,4-6周齡,體重60.809,BMSCs培養(yǎng)原代取材使用,由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供。
　　 (二)實(shí)驗(yàn)

11、方法
　　 l、利用酶聯(lián)免疫反心監(jiān)測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中PDGF-BB的含量。
　　 2、以0,10,20,50,100ng/ml的不通過濃度PDGF-BB孵育BMSCs24小時(shí)。
　　 3、免疫熒光、RT-PCR及westernblot測(cè)定VCAM-1表達(dá)量的改變。
　　 4、50ng/ml濃度的PDGF-BB孵育同時(shí)加入SB203850(10μM),LY294002(30μM),SP600125(10

12、μM),PD98059(10μM)及BAY11-7082(5μM)。免疫熒光、RT-PCR及westernblot測(cè)定抑制劑對(duì)BMSC的VCAM-1表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果:
　　 一、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)鑒定及向膠質(zhì)瘤細(xì)胞條件培養(yǎng)基的趨化
　　 1、全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,3天后即可觀察到貼壁細(xì)胞,4天以后呈指數(shù)級(jí)生長。一周后形成集落,并以集落化方式擴(kuò)增。大約12-14天生長至80-90%融

13、合。細(xì)胞形態(tài)比較均一,呈長梭型,呈旋渦狀、鋪路石狀,生長較密集。
　　 2、BMSC不表達(dá)CD34、CD45,陽性表達(dá)CD44、CD54、CD105,CD90及CD73。
　　 3、體外遷移實(shí)驗(yàn)證實(shí)C6及U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞的條件培養(yǎng)基吸引BIdSCs遷移。
　　 二、血管細(xì)胞粘附分子-1在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)及其對(duì)遷移的作用
　　 1、免疫組織化學(xué)染色及免疫熒光證實(shí)BMSC表達(dá)VCAM-1。
　　

14、 2、BMSCs向膠質(zhì)瘤的遷移可因阻斷VCAM-1而受到抑制。
　　 3、免疫熒光、RT-PCR及westernblot證實(shí)C6及U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞使BMSCs顯著上調(diào)表達(dá)VCAM-1。
　　 4、加入P13K抑制劑LY294002后,增強(qiáng)的VCAM-1表達(dá)受到顯著抑制。
　　 三、血小板衍生生長因子-BB對(duì)BMSCs的VCAM-1的表達(dá)調(diào)控
　　 1、ELISA結(jié)果顯示膠質(zhì)瘤培養(yǎng)上清含有PDGF-BB,

15、平均濃度為6.11ng/L和7.75ng/L。
　　 2、免疫熒光、RT-PCR及Westernblot結(jié)果顯示PDGF-BB顯著促進(jìn)BMSCs表達(dá)VCAM-1。
　　 3、10,20ng/ml的PDGF-BB未對(duì)BMSCs中VCAM-1的mRNA和蛋白的表達(dá)產(chǎn)生有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的影響,而50,100ng/ml的PDGF-BB顯著上調(diào)了BMSCs中VCAM-1的mRNA和蛋白的表達(dá)。
　　 4、P13K及P38MAP

16、K,NF-κB的抑制劑SB203850、LY294002及BAY11-7082分別顯著抑制了PDGF-BB誘導(dǎo)的VCAM-1mRNA和蛋白的表達(dá)上調(diào)。
　　 結(jié)論:
　　 1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞易于體外培養(yǎng)擴(kuò)增,不表達(dá)造血干細(xì)胞的標(biāo)志物CD34及CD45,陽性表達(dá)CD44、CD54、CD105、CD90及CD73。具有向C6或U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清的趨化遷移的能力。
　　 2、BMSCs上存在VCAM-1的表達(dá),