成神經(jīng)細胞分化的骨髓間充質干細胞對C6膠質瘤的趨向性研究.pdf

1、在神經(jīng)外科領域，膠質瘤的治療一直是神經(jīng)外科工作者面臨的最大挑戰(zhàn)之一，因為膠質瘤在中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤疾病中發(fā)病率最高，約占全部原發(fā)性腫瘤的40％-50％左右。目前臨床上治療膠質瘤以手術治療為主，輔以化療、放療、中醫(yī)治療、免疫治療等手段進行綜合治療。這種方案雖能產(chǎn)生一定療效，但膠質瘤的預后仍然不容樂觀。靶向治療的出現(xiàn)給我們帶來了新的希望，但由于攜帶目的基因或藥物的病毒載體存在半衰期短、趨向性弱和安全性等問題，目前未能取得預期的療效，值得我們深

2、入研究。
　　最近，骨髓間充質干細胞（bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCs）作為一種新型的載體而備受科學工作者的關注。BMSCs來源于中胚層，是一種具有自我更新能力和多向分化潛能的成體干細胞。與神經(jīng)干細胞(neuralstemcell,NSC)和胚胎干細胞(embryonicstemcell,ESC)等相比，BMSCs具容易獲取、方便培養(yǎng)、低免疫原性、不涉及倫理問題等優(yōu)點，近年來已成為干細胞領域

3、研究的熱點。根據(jù)BMSCs具有的生物學特性和對腫瘤的趨向性，目前很多研究者關注其在膠質瘤靶向治療中的應用，將其作為一種載體用于膠質瘤的治療成為的研究熱點。而BMSCs的分離、培養(yǎng)、鑒定、分化等基礎研究，作為進一步臨床應用的基礎，也成為BMSCs研究的重點。
　　BMSCs在體內向膠質瘤的遷移過程中，受周圍腦組織微環(huán)境的影響，可能使其分化而影響其對腫瘤區(qū)域遷移，最后到達膠質瘤部位的有效治療細胞很少，阻礙其發(fā)揮治療膠質瘤的作用。我們考

4、慮通過在體外模擬體內的微環(huán)境，讓BMSCs分化為較均一的神經(jīng)細胞后，再進行移植，可能是解決上述問題的有效方法。成神經(jīng)細胞分化的BMSCs（neurallydifferentiatedbonemarrowmesenchymalstemcells,N-D-BMSCs）可部分模擬顱內微環(huán)境中BMSCs分化產(chǎn)生的細胞，但尚不確定N-D-BMSCs是否對膠質瘤產(chǎn)生趨向性。如果N-D-BMSCs能夠向膠質瘤遷移，其主要的機制仍待闡明。基于以上問題，

5、本論文，在前面學者研究NSC和BMSCs分化的基礎上，首先，比較了營養(yǎng)因子和化學試劑誘導對BMSCs在體外誘導分化為神經(jīng)細胞的作用差異，并進一步探討N-D-BMSCs對C6膠質瘤細胞的趨向性研究，以及VEGF、MMP等分子在BMSCs遷移過程中的作用。鑒于以上的思路，我們的研究內容如下：
　　第一部分：BMSCs成神經(jīng)細胞分化
　　目的：觀察兩種新方案在體外誘導大鼠BMSCs向神經(jīng)細胞分化的效果。方法：取SD大鼠股骨的骨髓細

6、胞，利用Percoll法分離BMSCs，并且進行培養(yǎng)、純化及鑒定。取第3代細胞，應用兩種不同的方法進行誘導。方法一(營養(yǎng)因子誘導):含10％胎牛血清的(FBS)的α-MEM、2％B27、20ng/ml堿性成纖維生長因子（bFGF）、20ng/ml表皮生長因子（EGF）、10ng/ml腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)；方法二(化學誘導)：含10％FBS的α-MEM、2％B27、10μmol/L全反式維甲酸（ATRA）、10mmol/LBt2

7、CAMP，聯(lián)合誘導細胞。對照組用含10％FBS的α-MEM的標準培養(yǎng)基培養(yǎng)。分化進程中對細胞進行形態(tài)觀察，最后對細胞進行免疫熒光染色鑒定，對比分化效果。結果：兩種方法誘導后，細胞均出現(xiàn)胞體回縮、突觸伸展，呈現(xiàn)出神經(jīng)細胞形態(tài)。免疫熒光染色顯示兩種方法誘導的細胞不同程度的表達成熟神經(jīng)細胞標志物(NeuN)、
　　神經(jīng)細胞骨架標志物(NF-H)和神經(jīng)前體細胞標志物(Nestin)。方法一中Nestin(16.37±0.31)％的表達高于

8、方法二中Nestin(10.58±0.16)％的表達，方法一中NeuN(43.53±1.34)％和NF-H(40.76±0.53)％表達低于方法二中NeuN(47.63±1.06)％和NF-H(51.39±0.37)％的表達。結論：兩種方法均能誘導骨髓間充質干細胞在體外定向分化為神經(jīng)細胞。兩者相比，方法一誘導分化的神經(jīng)前體細胞較多，更接近顱內微環(huán)境；方法二更多的使BMSCs分化為成熟神經(jīng)細胞。
　　第二部分：N-D-BMSCs對C

9、6膠質瘤細胞的趨向性
　　目的：探討N-D-BMSCs在體外和體內向C6膠質瘤細胞趨向性的機制。方法：在體外實驗，采用Transwell小室共培養(yǎng)系統(tǒng)觀察N-D-BMSCs和C6膠質瘤條件培養(yǎng)基（C6GCM）共培養(yǎng)，HE染色分析穿過聚醋酸紙膜微孔的細胞數(shù)量。體內實驗，通過側腦室注射BrdU標記的N-D-BMSCs到大鼠C6膠質瘤模型中，免疫組化分析移植細胞的遷移能力。用ELISA試劑盒檢測C6GCM中的VEGF的含量。Transw

10、ell小室系統(tǒng)共培養(yǎng)N-D-BMSCs和中和部分VEGF因子的C6GCM共培養(yǎng)，HE染色分析穿過聚醋酸紙膜微孔的細胞數(shù)量。明膠酶譜實驗檢測BMSCs培養(yǎng)基中的MMP活性。結果：在體外實驗表明N-D-BMSCs對C6膠質瘤條件培養(yǎng)基有顯著趨向(P<0.01)；體內移植結果顯示BrdU陽性細胞明顯向腫瘤部位遷移并呈現(xiàn)時間特異性；C6GCM中含有VEGF；并且VEGF減少的GCM對N-D-BMSCs吸引減弱。N-D-BMSCs培養(yǎng)基中的含有M