人羊膜及臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞與C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞分別共培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景與目的:腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見(jiàn)的腫瘤,雖然在腦膠質(zhì)瘤的分子、基因方面的研究已經(jīng)取得了許多進(jìn)步,但患者的預(yù)后仍不滿意,目前手術(shù)切除仍是腦腫瘤治療的首選方法,但根治性切除后復(fù)發(fā)率高是影響其長(zhǎng)期生存率的主要因素。而國(guó)內(nèi)外均有文獻(xiàn)報(bào)道顯示MSCs具有抑瘤特性,本實(shí)驗(yàn)組在之前的研究中已經(jīng)觀察到hMSCs可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。另隨著C6大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的成熟發(fā)展,研究人員認(rèn)為C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的相關(guān)性研究對(duì)于人腦膠質(zhì)瘤的基礎(chǔ)研究具有參考和指導(dǎo)價(jià)值。

2、
　　本實(shí)驗(yàn)在建立人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(human mesenchymal stem cells hMSCs)及人臍帶間充質(zhì)細(xì)胞(human umbilicalcord stem cells hUSCs)的體外培養(yǎng)和鑒定方法的基礎(chǔ)上,探討hMSCs及hUSCs對(duì)于C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞不同共培養(yǎng)方法培養(yǎng)后可能出現(xiàn)的結(jié)果。
　　在本研究中,我們將通過(guò)在體外實(shí)驗(yàn)中分別進(jìn)行hMSCs與hUSCs和C6共培養(yǎng),觀察hMSCs與hUSCs和C6

3、的相互作用,進(jìn)一步明確hMSCs與hUSCs對(duì)C6生長(zhǎng)的影響的不同,以期為進(jìn)一步的研究提供參考和方向的選擇。
　　材料與方法:無(wú)菌條件下取正常足月剖腹產(chǎn)胎兒的羊膜和臍帶采用組織塊培養(yǎng)法及胰酶消化法分離并于含10％胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的MEM/F12培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。取P3代hMSCs及hUSCs采用免疫組織化學(xué)與流式細(xì)胞儀對(duì)其間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志CD29、CD44、HLA-ABC及CD29、CD4

4、4進(jìn)行鑒定和其細(xì)胞周期判定。取P3代的hMSCs及hUSCs,配制成濃度為1.0×10~6個(gè)/ml的直接共培養(yǎng)工作液與1.0×10~6個(gè)穩(wěn)定傳代3代以上C6單細(xì)胞懸液分別采用直接共培養(yǎng)和間接共培養(yǎng)的方法進(jìn)行共培養(yǎng),共分5組,羊膜直接共培養(yǎng)組(A組),羊膜間接共培養(yǎng)組(B組),臍帶直接共培養(yǎng)組(C組),臍帶間接共培養(yǎng)組(D組),空白對(duì)照組(E組),后光鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況,收集C6進(jìn)行流式細(xì)胞測(cè)定和電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察。
　　結(jié)果:用酶

5、消化法分離羊膜中的MSCs,可在體外進(jìn)行培養(yǎng),進(jìn)而通過(guò)貼壁分離法不斷得到純化。用酶消化法及組織塊培養(yǎng)法分離臍帶中的MSCs,可在體外進(jìn)行培養(yǎng),進(jìn)而通過(guò)貼壁分離法不斷得到純化。hMSCs及hUSCs免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示CD44和CD29均為陽(yáng)性反應(yīng):hMSCs及hUSCs的細(xì)胞周期分析具有干細(xì)胞的典型周期特性,流式細(xì)胞儀檢測(cè)傳代hMSCs陰性對(duì)照9.39％,CD29陽(yáng)性細(xì)胞比率為82.53％,CD44陽(yáng)性細(xì)胞比率為90.86％,HLA-A

6、BC陽(yáng)性細(xì)胞比率為89.55％。流式細(xì)胞儀檢測(cè)傳代hUSCs陰性對(duì)照7.61％,CD29陽(yáng)性細(xì)胞比率為70.44％,CD44陽(yáng)性細(xì)胞比率為75.50％.透射電鏡觀察見(jiàn)C6細(xì)胞不同程度出現(xiàn)細(xì)胞間連接消失,觀察像核分裂相減少,細(xì)胞體積縮小,細(xì)胞器空泡樣變及髓樣變改變,甚者出現(xiàn)細(xì)胞核固縮,出現(xiàn)典型細(xì)胞凋亡形態(tài),對(duì)照組E組細(xì)胞仍呈旺盛生長(zhǎng)狀態(tài)。C6細(xì)胞中bcl-2隨時(shí)間延長(zhǎng)陽(yáng)性表達(dá)率呈下降趨勢(shì),不同時(shí)間比較差異具有顯著性(P<0.01);C、D

7、兩組較A、B兩組陽(yáng)性表達(dá)率降低趨勢(shì)更為明顯,且兩兩比較差異具有顯著性(P<0.01);B、D兩組較A、C兩組陽(yáng)性表達(dá)率降低趨勢(shì)更為明顯(P<0.01)。C6細(xì)胞隨時(shí)間延長(zhǎng)細(xì)胞平均凋亡率呈上升趨勢(shì),不同時(shí)間比較差異具有顯著性(P<0.01);C、D兩組較A、B兩組陽(yáng)性表達(dá)率上升趨勢(shì)更為明顯,且兩兩比較差異具有顯著性(P<0.01);B、D兩組較A、C兩組陽(yáng)性表達(dá)率上升趨勢(shì)更為明顯(P<0.01)。
　　結(jié)論:1.Bcl-2在C6中呈