人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞與聚酸酐載體體外共培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:從人臍帶中分離、純化、培養(yǎng)原代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs),對其表面標(biāo)志物進(jìn)行鑒定、傳代培養(yǎng)、誘導(dǎo)其向肝樣細(xì)胞分化。觀察分化的肝樣細(xì)胞和聚酸酐復(fù)合載體支架在體外能否共同培養(yǎng),肝樣細(xì)胞的生長狀態(tài),評價聚酸酐復(fù)合載體支架對肝樣細(xì)胞生物活性的影響。
　　 方法:無菌條件下收集剖宮產(chǎn)新生兒臍帶,將臍血管經(jīng)過處理后,在培養(yǎng)皿內(nèi)剪碎至1mm3,然后移入培養(yǎng)瓶中,待細(xì)胞生長至80-90％融合時,按1:3傳代培養(yǎng),取傳代培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)

2、觀察、免疫細(xì)胞化學(xué)染色、流式細(xì)胞儀檢測其生長活性、并進(jìn)行細(xì)胞周期分析。將第六代的人臍帶MSCs接種在放有支架的24孔板上培養(yǎng),同時設(shè)置對照組。A組:人臍帶MSCs,加入HGF等誘導(dǎo)因子。B組:人臍帶MSCs,不加入任何誘導(dǎo)因子。C組:支架培養(yǎng)的人臍帶MSCs,不加入任何誘導(dǎo)因子。D組:與支架培養(yǎng)的人臍帶MSCs,加入HGF等誘導(dǎo)因子。在不同誘導(dǎo)階段收集細(xì)胞后觀察細(xì)胞形態(tài)。在誘導(dǎo)4周后取平板細(xì)胞上清液進(jìn)行生化檢測,主要項(xiàng)目包括:CYP45

3、0的活性、Albumin和尿素的含量。同時支架進(jìn)行石蠟包埋,進(jìn)行切片,HE染色觀察誘導(dǎo)后的肝樣細(xì)胞在支架中的生長情況,行免疫組織化學(xué)觀察肝細(xì)胞的表面標(biāo)志:CK19、AFP、ALB和C-Kit。
　　 結(jié)果:經(jīng)組織塊培養(yǎng)法可從臍帶中獲得MSCs,數(shù)量約1x108。觀察細(xì)胞形態(tài)為長梭形,不規(guī)則形,細(xì)胞大小不一,類似成纖維細(xì)胞,呈漩渦樣生長。取第6-9代細(xì)胞行免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示細(xì)胞強(qiáng)表達(dá)CD105、Vimentin,基本不表達(dá)C

4、D34、CD31、CD133。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測表達(dá)CD105(97.4±5％)、CD29(71.1±2.0％),基本不表達(dá)造血細(xì)胞標(biāo)志CD34(1.6±0.4％)。MTT實(shí)驗(yàn)顯示細(xì)胞倍增時間為22h。細(xì)胞周期分析表明75％-85％細(xì)胞處于G0/G1。HE染色結(jié)果顯示,誘導(dǎo)以后肝樣細(xì)胞與支架生長良好；檢測細(xì)胞上清液顯示:D組細(xì)胞分泌的CYP450(4.205±0.760 pg/ml)、Albumin(0.230±0.035g/dl)、尿素

5、(2.630±0.262 mg/dl)的含量與A、B和C組相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05),免疫組織化學(xué)顯示誘導(dǎo)組支架材料上Album、CK-19、AFP、C-Kit呈陽性反應(yīng)。
　　 結(jié)論:經(jīng)組織塊培養(yǎng)法可從臍帶中獲得間充質(zhì)干細(xì)胞,符合間充質(zhì)干細(xì)胞基本的生物學(xué)特性。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在HGF等誘導(dǎo)因子作用下可轉(zhuǎn)化為肝樣細(xì)胞,初步具備肝細(xì)胞特有的功能性特征。肝樣細(xì)胞與復(fù)合載體經(jīng)過連續(xù)30天共同培養(yǎng),肝樣細(xì)胞可以很好的貼附于聚酸酐復(fù)