人臍帶血間充質干細胞的體外分離、培養(yǎng)及鑒定.pdf

1、【目的】研究臍帶血間充質干細胞體外分離、培養(yǎng)條件，探討臍帶血間充質干細胞作為細胞治療種子細胞的可行性。 【方法】無菌條件下取正常足月產(chǎn)臍帶血36份，CAPD-1復合抗凝劑抗凝。其中18份臍血采用直接分離法，即將臍血稀釋后，直接用Ficoll分離單個核細胞，分別采用含5％、10％、20％血清濃度的L-DMEM常規(guī)間充質干細胞貼壁培養(yǎng)；其余18份臍血采用間接分離法，即將臍血用5g/L的甲基纖維素先沉降出紅細胞，然后將富集到的白細胞用

2、Ficoll進行密度梯度離心，獲得單個核細胞，同樣分別采用含5％、10％、20％血清濃度的L-DMEM進行培養(yǎng)；另外，無菌條件下取11份骨髓，按常規(guī)間充質干細胞分離培養(yǎng)法，分離培養(yǎng)骨髓作為陽性對照。對不同方法富集到的臍血單個核細胞數(shù)量進行對比，對臍血原代和傳代細胞的貼壁時間、貼壁細胞類型、生長速度進行觀察記錄，對各臍血組成功培養(yǎng)出間充質干細胞的例數(shù)進行統(tǒng)計分析，對分離出的臍血間充質干細胞進行鑒定并與骨髓間充質干細胞對比，采用流式細胞儀考

3、察臍血及骨髓中單個核細胞的細胞亞群以及間充質干細胞存在情況。 【結果】 1、兩種方法分離臍血單個核細胞的比較直接和間接分離法獲得的臍血有核細胞數(shù)量分別為(3.2±2.O)×10<'6>、(1.O±O.5)×10<'8>，存在顯著性差異(P<0.05)；兩種方法分離的有核細胞死亡率無顯著性差異(P>0.05)；兩種方法分離的細胞培養(yǎng)7天后在30<'2>cm培養(yǎng)瓶中的貼壁細胞克隆數(shù)分別為22±15，43±8，存在顯著性差異(

4、P<0.05)。 2、臍血組間充質干細胞生長特性并與骨髓組進行比較 臍血單個核細胞培養(yǎng)72小時后貼壁細胞均出現(xiàn)兩種形態(tài)，即梭形纖維狀的細胞和圓形細胞。經(jīng)過傳代擴增，有7／36份臍血出現(xiàn)均一旋渦狀排列的間充質樣的細胞，形態(tài)和骨髓間充質干細胞相同，其余29／36份臍血傳代后仍保持單核樣的圓形細胞及少量梭形細胞混雜，胰酶難以消化下來，不能分離純化出間充質樣的細胞，最終老化死亡。骨髓組單個核細胞培養(yǎng)24小時后，貼壁細胞多數(shù)為纖

5、維樣的間充質細胞，圓形貼壁細胞少，傳代后11／11份骨髓均分離出了間充質樣梭形細胞。兩種不同來源的間充質干細胞形態(tài)相同，但臍血間充質干細胞生長速度明顯慢于骨髓。 3、臍血間充質干細胞的免疫學標記特征 流式細胞儀檢測顯示，臍血間充質干細胞仍表達典型的間充質干細胞標記，即CD29(+)、CD44(+)、CDl05(+)，而CD34(-)。但與骨髓間充質干細胞比較存在表達數(shù)量上的差異，臍血間充質干細胞CDl05表達數(shù)量明顯少于

6、骨髓間充質干細胞。 4、臍血分離培養(yǎng)間充質干細胞成功率 臍血組分離培養(yǎng)間充質干細胞總的成功率為20％，骨髓組共分離培養(yǎng)11次，均獲得成功(100％)。不同的臍血分離培養(yǎng)法其成功率有顯著差異，其中直接法為11％，間接法33.3％。不同的血清濃度對培養(yǎng)成功率有一定的影響，其中以10％的血清濃度成功率最優(yōu)，直接法為16.7％，間接法為33.3％。 5、臍血和骨髓單個核細胞CD29／CD34雙色標記流式檢測CD29(PE

7、)、CD34(FITC)雙標流式細胞儀檢測結果顯示：臍血中可能的間充質干細胞群CD29(+)／CD34(-)細胞僅占全部單個核細胞的1.8％；而骨髓中CD29(+)／CD34(-)細胞群占單個核細胞的12.4％。 【結論】 1、分離獲得單個核細胞數(shù)量對臍血間充質干細胞的成功培養(yǎng)有很大的影響。采用甲基纖維素分離的間接法能顯著提高間充質干細胞分離培養(yǎng)的成功率。 2、單個核細胞的接種量和血清濃度對間充質干細胞成功培養(yǎng)有