人臍帶沃頓膠間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及其誘導(dǎo)分化.pdf

1、第一章人臍帶沃頓膠間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)
　　 目的：建立一種簡便、快捷、經(jīng)濟(jì)、高效臍帶沃頓膠間充質(zhì)于細(xì)胞的獲取方法。
　　 方法：臍帶剔除血管和外膜后，余下的膠凍狀組織，即沃頓膠(Wharton'sjelly,WJ)剪碎至1-2ram3大小，按一定比例均勻放置于含F(xiàn)asGrow培養(yǎng)基的6孔板中，37℃、5％的C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細(xì)胞游出后，用胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)并入液氮凍存。取第5代細(xì)胞行HE、Gimesa染色，觀

2、察細(xì)胞形態(tài)。
　　 結(jié)果：沃頓膠組織靜置培養(yǎng)7天左右，部分細(xì)胞從組織塊中游出，多為雙突起的長梭形、短棒狀或扁平形的成纖維樣細(xì)胞；14天左右，細(xì)胞形態(tài)變?yōu)榫坏募忓N形，細(xì)胞生長達(dá)到單位面積的70％～80％。傳代后可維持未分化狀態(tài)并穩(wěn)定增殖，細(xì)胞倍增時(shí)間為3d左右，體外增殖達(dá)20代以上；P3代以后，細(xì)胞形態(tài)較單一。復(fù)蘇后的細(xì)胞能很好生長，細(xì)胞形態(tài)，生長特點(diǎn)與凍存前基本一致。
　　 結(jié)論：種植法簡單、快捷、經(jīng)濟(jì)、高效，能從臍帶

3、沃頓膠中分離出大量成纖維樣細(xì)胞。
　　 第二章人臍帶沃頓膠間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定及誘導(dǎo)分化
　　 目的：判斷從臍帶沃頓膠中分離出的成纖維樣細(xì)胞是否是臍帶沃頓膠間充質(zhì)干細(xì)胞，并確定其分化潛能。
　　 方法：取第5代細(xì)胞進(jìn)行免疫組化，檢測其免疫表型。用含地塞米松、維生素C、B-甘油磷酸鈉的FasGrow培養(yǎng)基誘導(dǎo)該成纖維樣細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，并進(jìn)行堿性磷酸酶染色、VonKossa染色及四環(huán)素染色鑒定成骨細(xì)胞特性；用含地塞

4、米松、維生素C、異丁基甲基黃嘌呤的FasGrow培養(yǎng)基誘導(dǎo)該成纖維樣細(xì)胞向成脂細(xì)胞分化，并進(jìn)行油紅O染色鑒定成脂細(xì)胞特性；用含β-巰基乙醇的FasGrow培養(yǎng)基誘導(dǎo)該成纖維樣細(xì)胞向神經(jīng)樣細(xì)胞分化，并通過特異性抗體鑒定其分化能力。
　　 結(jié)果：表面標(biāo)記分析顯示：CD44、CDI05、CD133、MHC-I呈陽性，CD34、CD45呈陰性，從臍帶沃頓膠中分離出的成纖維樣細(xì)胞為間充質(zhì)干細(xì)胞；體外誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)表明：該細(xì)胞具有體外成脂肪、成骨