山羊胎肺間充質(zhì)干細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)與誘導(dǎo)分化.pdf

1、間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是干細(xì)胞的一種，具有很強(qiáng)的自我更新和多向分化潛能。MSCs存在于動物胎兒和成體多種組織中，現(xiàn)有研究已經(jīng)從多個(gè)物種的多種組織中提取分離出間充質(zhì)干細(xì)胞，而目前研究最多的MSCs主要是骨髓源MSCs，對胎肺來源干細(xì)胞的研究還很少有報(bào)道。胎肺間充質(zhì)干細(xì)胞相對于骨髓源MSCs來說有取材方便、細(xì)胞數(shù)量多、容易分離得到及體外能夠大量擴(kuò)增等優(yōu)勢，因此建立哺乳動物胎肺來源干細(xì)胞分離培養(yǎng)

2、和鑒定的方法可以豐富干細(xì)胞來源、對研究細(xì)胞發(fā)育分化、建立疾病模型均有促進(jìn)作用。
　　本研究以阿爾卑斯絨山羊胎兒肺部組織為材料來源，首先分離得到可以在體外長期傳代培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞，之后對得到的細(xì)胞進(jìn)行了形態(tài)學(xué)、生長性能、標(biāo)志基因等方面鑒定，最后對間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行成脂、成骨、成軟骨、成胰島、成神經(jīng)細(xì)胞等多胚層組織的誘導(dǎo)分化，驗(yàn)證其多能性。
　　本研究主要是采用兩步酶消化法和差速貼壁法分離阿爾卑斯絨山羊胎兒肺部組織，通過形態(tài)學(xué)觀

3、察，發(fā)現(xiàn)所分離出的山羊胎肺細(xì)胞形態(tài)均一，呈現(xiàn)成纖維樣細(xì)胞形態(tài)，增殖能力旺盛，在體外傳代培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)傳至20代以上細(xì)胞仍然保持良好的生物學(xué)性狀。進(jìn)一步通過核型分析、生長曲線測定、免疫細(xì)胞化學(xué)、RT-PCR技術(shù)鑒定其MSCs特性。其結(jié)果顯示，所分離的山羊胎肺細(xì)胞具有正常二倍體核型(2n=60);在體外生長正常，具有穩(wěn)定生物學(xué)性狀;RT-PCR顯示間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志性基因CD44表達(dá)呈陽性;免疫細(xì)胞化學(xué)檢測細(xì)胞表面標(biāo)記CD13、CD29、CD44

4、、CD90、CD106基因的表達(dá)與陰性對照組相比都呈陽性，造血干細(xì)胞標(biāo)志基因CD45呈陰性。表明本研究分離得到的細(xì)胞具備山羊間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性。
　　在確定了適合于山羊胎肺間充質(zhì)干細(xì)胞(LMSCs)培養(yǎng)和鑒定方法的基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步對所分離的山羊胎肺間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行成脂、成骨、成軟骨、成胰島、成神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)，觀察其向三胚層分化的多潛能情況。經(jīng)過細(xì)胞染色、免疫細(xì)胞化學(xué)及RT-PCR技術(shù)進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示:成脂誘導(dǎo)后，

5、細(xì)胞經(jīng)油紅-O染色可見明顯脂滴，RT-PCR顯示成脂細(xì)胞特異性基因PPARγ2表達(dá)呈陽性;成骨誘導(dǎo)經(jīng)AgNO3染色后有明顯鈣化物質(zhì)，RT-PCR顯示成骨細(xì)胞特異性基因collagenⅠ表達(dá)呈陽性;成軟骨誘導(dǎo)經(jīng)阿利新藍(lán)染色后呈藍(lán)色，RT-PCR顯示成軟骨特異基因COL2A1表達(dá)呈陽性;成胰島β細(xì)胞誘導(dǎo)后經(jīng)雙硫腙染色發(fā)現(xiàn)，有細(xì)胞團(tuán)出現(xiàn)，并且呈猩紅色，RT-PCR顯示胰島β細(xì)胞標(biāo)記基因PDX1表達(dá)呈陽性;成神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)后，經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)檢測，