人臍帶沃頓膠間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療對(duì)大鼠腦損傷區(qū)微循環(huán)的影響.pdf

1、背景:
　　創(chuàng)傷性顱腦損傷(traumaticbraininjury,TBI)是神經(jīng)外科最常見的疾病之一，隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的飛快發(fā)展，跌落傷、交通傷、以及暴力傷等引起的TBI患者也同比增加。TBI的幸存者大部分都留下了不同程度的神經(jīng)心理疾病及肢體運(yùn)動(dòng)感覺障礙等，影響了他們的工作、生活以及社會(huì)活動(dòng)，他們一般都要進(jìn)行長時(shí)間的康復(fù)治療，并且需要陪護(hù)，這就浪費(fèi)了大量的社會(huì)資源。微循環(huán)的主要功能是進(jìn)行物質(zhì)交換，以及通過微動(dòng)脈阻力的變化控制組織器

2、官血流量的大小，可是微循環(huán)的血管的舒縮活動(dòng)的控制主要與局部的代謝活動(dòng)有關(guān)，因此局部代謝的變化會(huì)造成微循環(huán)的障礙，進(jìn)一步導(dǎo)致器官的生理功能受到影響。創(chuàng)傷性顱腦損傷出現(xiàn)的腦微循環(huán)的障礙是該病極為重要的病理生理學(xué)變化，是繼發(fā)性損害的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也是疾病轉(zhuǎn)歸和影響神經(jīng)功能恢復(fù)的關(guān)鍵因素。防治創(chuàng)傷性顱腦外傷后的腦微循環(huán)障礙是神經(jīng)外科重點(diǎn)關(guān)注的領(lǐng)域之一。
　　有研究證實(shí)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療骨缺損時(shí)分泌血管內(nèi)皮生長因子(vascularend

3、othelialgrowthfactor，VEGF)可以促進(jìn)新生血管生成，但是對(duì)于創(chuàng)傷性顱腦損傷損傷區(qū)微循環(huán)的影響尚未可知，并且骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞由于取材不便、細(xì)胞數(shù)量受年齡限制等原因限制了應(yīng)用前景。人臍帶沃頓膠間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstromalcellsderivedfromWharton'sjellycells，WJCs)具有來源廣泛，且較其它間充質(zhì)干細(xì)胞易于分離培養(yǎng)、能夠大量獲取、且增殖分化能力較強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。人臍帶沃頓

4、膠間充質(zhì)干細(xì)胞可以通過促進(jìn)各種營養(yǎng)因子的分泌對(duì)受損的神經(jīng)系統(tǒng)起到保護(hù)及治療作用。目前尚沒有關(guān)于人臍帶沃頓膠間充質(zhì)干細(xì)胞移植后對(duì)腦損傷區(qū)域的腦微循環(huán)變化的研究，本研究將致力于人臍帶沃頓膠間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)腦損傷區(qū)微循環(huán)的影響。
　　近年來，功能磁共振成像技術(shù)取得了飛速的發(fā)展，除了能顯示的形態(tài)結(jié)構(gòu)學(xué)信息，還可以反映腦損傷后代謝、生理等方面的功能改變的信息。磁共振灌注成像(perfusion-weightedimaging,PWI)，常

5、采用單次激發(fā)的平面回波自由感應(yīng)衰減(echoplanarimagingoffreeinductiondecay,EPI-FID)序列，注入的造影劑到達(dá)腦組織感興趣區(qū)，使局部磁場改變而獲得信號(hào)。PWI能夠檢出局部組織的血流灌注情況，并且可以分析血流動(dòng)力學(xué)的改變以及功能的變化，并能根據(jù)需要重點(diǎn)反映組織的微血管分布以及血流灌注的情況。
　　目的:
　　觀察人臍帶沃頓膠間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)SD大鼠腦損傷區(qū)域的微循環(huán)變化的影響，探討微循

6、環(huán)變化對(duì)損傷區(qū)腦組織的保護(hù)及修復(fù)作用。
　　材料與方法:
　　1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:SPF級(jí)雄性SD大鼠72只(8周齡，體重250～300g)由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。跟據(jù)國家發(fā)布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行適宜的安置。讓大鼠自由的攝食與飲水，室溫始終控制在（23±2）℃，相對(duì)濕度控制在40％-60％。
　　2.細(xì)胞的分離與培養(yǎng):離體的臍帶由健康足月剖宮產(chǎn)產(chǎn)婦志愿捐獻(xiàn)，由鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科提供，無

7、菌環(huán)境下取臍帶一段，剝離臍帶外膜，將沃頓膠組織剪碎后放置于含有bFGF(20μg/L)和FBS(10％)的DMEM/F12培養(yǎng)基中，在含有CO2(5％)的37攝氏度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)及傳代。取傳代至P3代的人臍帶沃頓膠間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行鏡下觀察及流式細(xì)胞儀檢測。
　　3.TBI模型的制作及分組:模型的建立采用Feeney的自由落體撞擊法，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)建立大鼠中度創(chuàng)傷性顱腦損傷模型。72只SD大鼠被隨機(jī)分為4組:依次為假手術(shù)組（A組）

8、，切開頭部皮膚，顱骨鉆孔后不損傷腦組織不移植細(xì)胞;移植對(duì)照組（B.組），制作中度創(chuàng)傷性顱腦損傷模型成功后經(jīng)股靜脈靜脈注射0.3ml生理鹽水;WJCs移植組（C組），制作中度創(chuàng)傷性顱腦損傷模型成功后經(jīng)股靜脈靜脈注射WJCs混懸液0.3ml;正常組（D組），無任何損傷及干預(yù)措施。
　　4.PWI序列掃描:采用美國GE公司DiscoveryMR7503.0T高場強(qiáng)磁共振儀和大鼠專用線圈，各組大鼠均進(jìn)行橫軸位T1加權(quán)成像(T1-weigh

9、tedimaging,T1WI)和T2加權(quán)成像(T2-weightedimaging,T2WI)、矢狀位T2WI、冠狀位T2WI及PWI的掃描。根據(jù)橫軸位T2WI掃描圖像為參考，觀察大鼠腦外傷后損傷灶周圍皮質(zhì)、丘腦、海馬及對(duì)側(cè)相應(yīng)部位在磁共振圖像上隨時(shí)間的變化情況，并記錄相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)相應(yīng)部位腦組織的參數(shù)包括CBF和CBV。計(jì)算上述指標(biāo)的相對(duì)值（傷側(cè)/健側(cè)），分別得到rCBF和rCBV，盡可能降低個(gè)體差異所引起的誤差。比較實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組大鼠

10、感興趣區(qū)rCBF和rCBV值是否有顯著差異。
　　5.組織學(xué)觀察:采用mNSS行為學(xué)評(píng)分法評(píng)價(jià)大鼠神經(jīng)功能;組織學(xué)切片觀察大鼠顱腦損傷的移植細(xì)胞生存狀況，及損傷區(qū)微循環(huán)的變化;電鏡觀察損傷區(qū)周圍的神經(jīng)細(xì)胞的存活狀態(tài)。
　　6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用(X)±SD表示。正常對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組計(jì)量資料比較采用兩隨機(jī)樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:

11、　　1.行為學(xué)評(píng)分:大鼠在建立創(chuàng)傷性顱腦損傷模型后，其神經(jīng)運(yùn)動(dòng)及感覺功能的恢復(fù)在7d是呈現(xiàn)出一定的差異性，根據(jù)mNSS行為學(xué)評(píng)分結(jié)果，A組和D組因?yàn)槲词艽驌?，所以其神?jīng)運(yùn)動(dòng)感覺功能正常為0分，B組（10.22±0.94），C組（9.02±1.06），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2.功能磁共振檢測:TBI大鼠的顱腦損傷區(qū)的PWI序列掃描結(jié)果經(jīng)整理得出rCBF和rCBV，rCBF和rCBV經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析顯示大鼠的腦損傷區(qū)在7d

12、時(shí)B組和C組的差異明顯，A組（99.24±0.87;101.36±0.98），B組（123.68±18.89;102.55±17.46），C組（131.03±17.37;115.21±14.66）和D組（99.56±0.51;99.68±0.84），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3.組織學(xué)觀察:TBI大鼠的顱腦損傷區(qū)的微血管面密度在3d，7d和2w時(shí)，B組與C組比較差異明顯，B組3d、7d和2w是結(jié)果分別為(9.56±3

13、.78)，（20.62±3.25），(21.93±2.12)，C組3d、7d和2w是結(jié)果分別為（12.38±2.45），（31.79±3.28），（33.59±3.52），有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。TBI大鼠的顱腦損傷區(qū)的血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactorVEGF)的陽性染色顯示，B組在3d、7d和2w均低于C組。TBI大鼠的顱腦損傷區(qū)在2w和4w行免疫組化觀察膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glia

14、lfibrillaryacidicproteinGFAP)的陽性表達(dá)率顯示，B組無陽性染色，C組有陽性染色。TBI大鼠的顱腦損傷區(qū)在2w和4w行免疫組化觀察神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuronspecificenolaseNSE)蛋白陽性表達(dá)率顯示，B組無陽性染色，C組有陽性染色。
　　結(jié)論:
　　WJCs經(jīng)股靜脈移植可以顯著促進(jìn)VEGF在腦損傷區(qū)的表達(dá)，促進(jìn)腦損傷區(qū)周圍腦組織的毛細(xì)血管的生成。通過改善損傷局部的腦微循環(huán)，對(duì)創(chuàng)