人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對急性肺損傷氧化應(yīng)激的影響.pdf

1、研究背景：
　　 急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是由多種肺內(nèi)外致病因素導(dǎo)致的一種危重病癥，其基本特征為肺內(nèi)微血栓形成和大量炎性細(xì)胞浸潤，其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，故目前尚無有效的治療手段，其病死率高達(dá)40％。Lima等的研究證實(shí)氧化應(yīng)激在肺損傷模型的結(jié)構(gòu)、功能和炎癥反應(yīng)中都扮演了很重要的角色，這提示如果糾正氧化應(yīng)激失衡就有可能減輕急性肺損的程度，為急性肺損傷的治療提供新的方向與方法。
　　 間充質(zhì)

2、干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是一類具備自我復(fù)制(self-renewal)和多向分化潛能的成體干細(xì)胞，最初在骨髓中發(fā)現(xiàn)，而后在脂肪、肌肉等組織中都發(fā)現(xiàn)了這種特殊的細(xì)胞。因其特殊的生物學(xué)特性，間充質(zhì)干細(xì)胞現(xiàn)己經(jīng)逐漸成為組織工程和臨床再生醫(yī)學(xué)的重要種子細(xì)胞。當(dāng)前，間充質(zhì)干細(xì)胞的主要來源仍然是骨髓。但由于它的獲取途徑為有創(chuàng)操作過程，且骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem

3、 cell，BMMSC)的數(shù)量和活性都隨著供者年齡的增長而顯著降低，且存在染毒風(fēng)險(xiǎn)。以上的缺點(diǎn)，大大制約了間充質(zhì)干細(xì)胞在組織工程和臨床再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。目前，已有大量研究證實(shí)，人類臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，HUMSCs)來源廣泛，無倫理學(xué)制約，且較骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞更易體外擴(kuò)增，并具有更低的免疫原性，因而己經(jīng)越來越受到人們的重視，逐漸成為組織工程和再生醫(yī)

4、學(xué)中最具發(fā)展前景的種子細(xì)胞。HUMSCs的發(fā)現(xiàn)與成功分離有可能為急性肺損傷的治療帶來新的曙光。之前已有大量研究證明間充質(zhì)干細(xì)胞移植后不僅具有分化能力，還具有免疫調(diào)節(jié)等功能，但是國內(nèi)外罕有HUMSCs是否對急性肺損傷氧化應(yīng)激存在影響的相關(guān)報(bào)道。
　　 目的：
　　 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離，培養(yǎng)和鑒定，并探討其移植對脂多糖誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷氧化應(yīng)激的可能影響。
　　 方法：
　　 1、人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的

5、分離與培養(yǎng)
　　 無菌條件下取足月剖宮產(chǎn)產(chǎn)婦的臍帶，用PBS沖凈殘留的血液，用眼科剪盡量剪碎，先用膠原酶Ⅱ消化30min，離心后再用胰酶消化30min，用100目濾網(wǎng)過濾除去未消化組織，加入含10％胎牛血清并已加入青/鏈霉素的DMEM/F12的完全培養(yǎng)基，接種到一次性細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長到80％融合時(shí)，進(jìn)行消化傳代和擴(kuò)增培養(yǎng)。在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形念學(xué)改變并拍照記錄。
　　 2、人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞

6、表面標(biāo)志鑒定
　　 用流式細(xì)胞儀檢測人臍帶來源問充質(zhì)干細(xì)胞CD29、CD34、CD44、CD105的表達(dá)情況。
　　 3、人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞多向分化能力鑒定
　　 油紅O染色法和茜素紅染色法分別鑒定HUMSCs向脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞的分化能力。
　　 4、觀察人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植對脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷大鼠肺組織病理學(xué)的影響
　　 自各組大鼠左肺下葉取一小塊肺組織，用10％福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包

7、埋、切片、HE染色。光鏡下觀察肺組織形態(tài)、結(jié)構(gòu)變化，并拍照。
　　 5、測定人臍帶間充質(zhì)于細(xì)胞移植對脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷大鼠肺組織濕干重的影響
　　 自各組大鼠右肺下葉取一小塊肺組織，稱量濕重，然后置于恒溫烤箱烤至恒重，稱量干重，計(jì)算肺濕/干重比=濕重/干重。
　　 6、探討人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植對脂多糖誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷氧化應(yīng)激的影響
　　 將30只Wistar大鼠隨機(jī)分為生理鹽水(NS)對照組(A

8、組)、LPS模型組（B組）和HUMSCs移植組（C組），每組10只。移植6h后，處死各組大鼠，取肺組織行病理學(xué)觀察，肺濕/干重比測定，丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測。
　　 結(jié)果：
　　 1、組織碎塊消化第3天起，可見少量貼壁的細(xì)胞，形態(tài)較小，細(xì)胞核不明顯，其余大部分未消化的組織碎塊懸浮于培養(yǎng)液表面。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，貼壁的細(xì)胞逐漸增多。約7天后，可見部分貼壁細(xì)胞呈扁平形或長梭形，10天后，貼壁

9、細(xì)胞明顯增多，可見典型的梭狀成纖維樣細(xì)胞，并呈漩渦狀生長，2周左右時(shí)可達(dá)80％融合。經(jīng)傳代培養(yǎng)，可得到逐漸純化的HUMSCs，同時(shí)細(xì)胞形態(tài)無明顯變化，性質(zhì)穩(wěn)定，至少能傳代30代以上。
　　 2、流式細(xì)胞儀鑒定紡錘樣細(xì)胞高表達(dá)CD29、CD44和CD105，幾乎不表達(dá)造血系標(biāo)志CD34，符合HUMSCs的表面標(biāo)志特征。
　　 3、HUMSCs經(jīng)特定培養(yǎng)基誘導(dǎo)后能分化為脂肪細(xì)胞或成骨細(xì)胞。
　　 經(jīng)油紅O染色后細(xì)胞核

10、呈藍(lán)色，脂滴呈紅色。對照組未見含紅色脂滴的細(xì)胞。經(jīng)茜素紅染色后細(xì)胞之間有大量的紅色鈣結(jié)晶析出，鈣結(jié)節(jié)呈圓形或多邊形，折光性強(qiáng)，對照組細(xì)胞排列緊密，未見鈣結(jié)節(jié)形成。
　　 4、HUMSCs移植能明顯減輕急性肺損傷時(shí)炎性細(xì)胞浸潤程度和肺組織的損傷程度。
　　 對照組肺組織結(jié)構(gòu)正常，肺泡結(jié)構(gòu)完整光滑。LPS模型組肺組織水腫，少量出血，光鏡下觀察可見大量炎性細(xì)胞浸潤，肺泡壁破壞，肺泡問隔增厚，上述病理形態(tài)改變符合ALI的表現(xiàn)。H

11、UMSCs移植組炎性細(xì)胞浸潤明顯減少，肺損傷程度較模型組顯著減輕。
　　 5、HUMSCs移植能減輕急性肺損傷時(shí)肺組織的水腫程度。
　　 與對照組比較，模型組肺W/D比明顯增加(P＜0.05)。與模型組比較，HUMSCs移植組肺W/D比明顯降低(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 6、HUMSCs移植能減少急性肺損傷時(shí)肺組織內(nèi)MDA的含量，并提高肺組織內(nèi)SOD的活性。
　　 與對照組比較，模型組肺組

12、織MDA含量明顯升高(P＜0.05)；與模型組相比，HUMSCs移植組MDA含量明顯降低(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與對照相比，模型組SOD活性明顯降低(P＜0.05)；與模型組相比，HUMSCs移植組SOD活性明顯升高(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：
　　 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，B組在注射LPS后6h產(chǎn)生了明顯的肺部損傷，同時(shí)機(jī)體抗氧化應(yīng)激能力顯著下降。B組肺組織中MDA含量顯著高于A組，肺組織內(nèi)S

13、OD活性顯著低于A組。說明LPS所致的肺損傷使肺部發(fā)生了強(qiáng)烈的氧化應(yīng)激。這不僅可直接損傷肺泡上皮細(xì)胞及肺泡毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，還可通過肺部脂質(zhì)過氧化反應(yīng)繼續(xù)產(chǎn)生大量氧自由基，并以多種途徑造成肺泡毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。正常狀態(tài)下，機(jī)體抗氧化系統(tǒng)可以清除過量的氧自由基，使機(jī)體不會被氧自由基損傷。而注射LPS后，肺部發(fā)生了強(qiáng)烈的氧化應(yīng)激，機(jī)體抗氧化應(yīng)激能力不足，導(dǎo)致了嚴(yán)重的肺損傷。
　　 HUMSCs移植能顯著減輕LPS誘導(dǎo)的大鼠AL