人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)急性肺損傷模型中的治療作用與機(jī)制初探.pdf

1、第一部分人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定
　　目的:建立穩(wěn)定、高效的體外分離培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(HUC-MSCs)的方法，為采用HUC-MSCs治療急性肺損傷模型做前期準(zhǔn)備。
　　方法:貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)HUC-MSCs。手術(shù)臺(tái)取正常足月健康嬰兒臍帶組織，剪去兩端結(jié)扎絲線，無(wú)菌條件下D-Hanks緩沖液洗滌殘留血液，剖開(kāi)臍帶，去除靜脈、動(dòng)脈、外膜，并將其剪碎至1 mm×1mm大小組織塊，均勻接種于75cm2培養(yǎng)瓶中，加入

2、完全培養(yǎng)基5ml，倒置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)4h后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)培養(yǎng)瓶，24h后添加培養(yǎng)基至12ml。每3d半量換液一次，去除未貼壁組織塊。待細(xì)胞80％融合時(shí)，用0.25％胰蛋白酶消化，按照2∶1比例進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)。利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)P3代細(xì)胞表面標(biāo)記物CD34、CD45、HLA-DR、CD73、CD90及CD105表達(dá)。同時(shí)利用成骨、成脂及成軟骨條件培養(yǎng)誘導(dǎo)分化第3代細(xì)胞，在7天后分別觀測(cè)細(xì)胞的成骨、成脂及成軟骨分化能力。成骨誘導(dǎo)第20d后，茜素

3、紅染色鑒定HUC-MSCs成骨分化潛能。成脂誘導(dǎo)15d后，油紅O染色鑒定HUC-MSCs成脂分化能力，成軟骨組織形成后進(jìn)行阿新藍(lán)染色鑒定成軟骨分化能力。
　　結(jié)果:原代培養(yǎng)的細(xì)胞約24 h內(nèi)貼壁生長(zhǎng)，培養(yǎng)96 h后在倒置顯微鏡下觀察可見(jiàn)臍帶組織碎塊周?chē)霈F(xiàn)三角形和成纖維樣貼壁細(xì)胞，培養(yǎng)12d后，細(xì)胞融合度達(dá)到80-90％，細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞樣漩渦式生長(zhǎng)，經(jīng)過(guò)連續(xù)傳代10次，細(xì)胞變?yōu)樾螒B(tài)更為均一的成纖維樣，細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯改變、無(wú)衰老。

4、流式細(xì)胞儀檢測(cè)HUC-MSCs細(xì)胞表面抗原CD34，CD45，CD73，CD90，CD105，HLA-DR表達(dá)率分別是0.19，0.19，99.96，99.10，99.42，0.10，符合HUC-MSCs細(xì)胞表面標(biāo)志物特點(diǎn)。成骨誘導(dǎo):誘導(dǎo)第10d可觀察到細(xì)胞上方有懸浮的白色鈣結(jié)節(jié)，第20 d茜素紅染色可見(jiàn)白色鈣結(jié)節(jié)呈鐵銹紅染色。成脂誘導(dǎo):誘導(dǎo)第5d觀察到細(xì)胞胞質(zhì)中開(kāi)始有脂滴形成，第15d油紅O染色可見(jiàn)脂滴紅染。成軟骨誘導(dǎo):細(xì)胞團(tuán)塊在25

5、d左右會(huì)變得致密，阿新藍(lán)染色后成深藍(lán)色。
　　結(jié)論:采用貼壁培養(yǎng)法分離、培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的方法穩(wěn)定、可靠，可以獲得純度較高具有多向分化能力的HUC-MSCs。
　　第二部分急性肺損傷模型的建立以及人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)其治療作用
　　目的:建立脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的急性肺損傷(ALI)模型，觀察HUC-MSCs對(duì)ALI模型臨床指標(biāo)的影響，研究HUC-MSCs對(duì)ALI模型的保護(hù)作用。
　　方法:將BALB/c小

6、鼠分為PBS+PBS（對(duì)照組），PBS+MSCs（干細(xì)胞對(duì)照組），LPS+PBS（模型組），LPS+MSCs（治療組），每組6只老鼠。10％水合氯醛(3ml/kg)腹腔注射麻醉，在麻醉狀態(tài)下行氣管插管術(shù)，PBS+PBS組、PBS+MSCs組和LPS+PBS組、LPS+MSCs組分別給予30μ l PBS和30μ l LPS(5mg/kg)。1h后PBS+MSCs組和PBS+MSCs組經(jīng)氣管插管給70μ l HUC-MSCs懸液（1×10

7、6/只），PBS+PBS和LPS+PBS組經(jīng)氣管插管給PBS（70μ l/只）。分別在HUC-MSCs給入后第1、3、5d，處死收集肺組織標(biāo)本，觀察肺組織病理改變并進(jìn)行炎癥評(píng)分，計(jì)算肺組織濕/干重比(W/D)。
　　結(jié)果:經(jīng)氣管插管給予LPS構(gòu)建的ALI模型組，與對(duì)照組比較，H&E染色結(jié)果表明炎癥浸潤(rùn)明顯、肺泡間隔增厚、肺出血嚴(yán)重及表現(xiàn)肺組織水腫的W/D的增加，表明ALI構(gòu)建模型成功。HUC-MSCs治療ALI模型改善了小鼠死亡率

8、，緩解其缺氧狀態(tài)，肺組織病理學(xué)觀察可見(jiàn)ALI+MSCs組第3，5d處理組肺泡及支氣管周?chē)装Y細(xì)胞明顯減少、肺泡間隔縮小、肺泡間隙出血明顯減輕。肺組織病理評(píng)分評(píng)價(jià)在HUC-MSCs治療ALI模型第3d對(duì)對(duì)肺泡阻塞程度、肺泡間隔厚度、肺水腫程度有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　結(jié)論:經(jīng)氣管給予LPS可以成功構(gòu)建ALI模型，HUC-MSCs可以減輕ALI小鼠模型肺組織損傷程度，改善水腫對(duì)ALI小鼠模型具有保護(hù)作用。
　　第三

9、部分人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療急性肺損傷模型的機(jī)制初探
　　目的:探究HUC-MSCs對(duì)急性肺損傷模型的免疫調(diào)節(jié)作用，明確HUC-MSCs治療急性肺損傷模型的分子機(jī)制。
　　方法:DAPI標(biāo)記HUC-MSCs，氣管插管給HUC-MSCs后示蹤其在肺組織的分布及轉(zhuǎn)移。將BALB/c小鼠分為PBS+PBS組，PBS+MSCs組，LPS+PBS組，LPS+MSCs組，每組6只老鼠。分別在HUC-MSCs給入后第1、2、3d處死小鼠收集

10、BALF標(biāo)本。對(duì)肺泡灌洗液炎性細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類計(jì)數(shù)并測(cè)定BALF中總蛋白含量，檢測(cè)肺組織中髓過(guò)氧化物酶MPO活性。蛋白芯片檢測(cè)LPS+PBS組與LPS+MSC組BALF中308種蛋白表達(dá)。篩選表達(dá)有差異蛋白并用ELISA方法驗(yàn)證BALF中炎癥因子的表達(dá)。
　　結(jié)果:DAPI可以高效率的標(biāo)記HUC-MSCs，氣管插管5h后HUC-MSCs可在肺組織中均勻分布，24h后逐漸減少。LPS+MSC組與LPS+PBS組相比BALF中細(xì)胞總數(shù)降