人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞向成肌細(xì)胞分化的體外研究.pdf

1、研究背景和目的：人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord blood mesenchymal stem cells，hUCB—MSCs)具有其他組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性。目前的研究表明hUCB—MSCs含量較少，培養(yǎng)體系眾多，但培養(yǎng)效率較低。對UCB—MSCs體外向成肌細(xì)胞分化的研究不夠深入。因此，我們選擇hUCB—MSCs作為研究的種子細(xì)胞，優(yōu)化體外培養(yǎng)條件，探討其體外誘導(dǎo)成肌細(xì)胞的能力，為肌源性疾病的

2、治療提供理想的種子細(xì)胞。 實驗方法：①hUCB—MNCs培養(yǎng)體系的建立：應(yīng)用淋巴細(xì)胞分離液法、羥乙基淀粉沉降法和羥乙基淀粉+淋巴細(xì)胞分離液兩步法三不同方法分別從臍帶血中獲得單個核細(xì)胞(mononuclear cells，MNCs)，應(yīng)用L—DMEM、DMEM/F12和MesencultTM不同培養(yǎng)基，在不同胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)濃度和細(xì)胞接神密度下，培養(yǎng)UCB—MNCs。比較所獲得的MNCs數(shù)量

3、、原代培養(yǎng)時間和不同培養(yǎng)條件下hUCB—MSCs的生長情況。流式細(xì)胞儀對P3細(xì)胞進行細(xì)胞表面標(biāo)記鑒定，并誘導(dǎo)成骨，觀察其生物學(xué)特征。②基于上一部分的UCB—MSCs培養(yǎng)體系，建立以5—氮雜胞苷(5—azacytidine，5—Aza)為誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)成肌分化體系：MTT法選擇5—Aza適宜的誘導(dǎo)濃度，對P3 hUCB—MNCs進行體外向成肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化，于誘導(dǎo)后第7d和第14d進行MyoD1、myogenin和myosin heavy c

4、hain免疫熒光染色和Real-Time PCR檢測。 實驗結(jié)果：建立了hUCB—MSCs穩(wěn)定有效的培養(yǎng)體系：應(yīng)用羥乙基淀粉+淋巴細(xì)胞分離液兩步法采集單個核細(xì)胞的數(shù)量較多(P<0.01)；10％FBS DMEM/F12和MesencultTM培養(yǎng)基，T25培養(yǎng)瓶中細(xì)胞接種密度為5×107時培養(yǎng)效率高于各對照組(P<0.01)；貼壁細(xì)胞表達CD29、CD105，不表達CD34、CD45、CD90、CD133；經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)21d后

5、，細(xì)胞Von Kossa染色可見礦化結(jié)節(jié)。P3 UCB—MNCs經(jīng)5μmmol/L5—Aza誘導(dǎo)7d后，免疫熒光檢測僅表達MyoD1；當(dāng)誘導(dǎo)后14d時，可見MyoD1和myogenin陽性表達。始終無myosin heavy chain的表達。Real-Time PCR檢測顯示誘導(dǎo)后14d較7d，MyoD1和myogenin的相對濃度增高，而無myosin heavy chain的表達。另外，在未誘導(dǎo)條件下UCB—MNCs同樣能表達My