miR-21促進(jìn)臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞血管向分化作用的初步研究.pdf

1、目的：研究 miR-21促進(jìn)臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞（ umbilical cord blood derived mesenchymal stem cells，UCBMSCs）血管向分化的作用，觀察 miR-21過表達(dá)UCBMSCs在裸鼠下肢缺血模型中的血管再生效果。
　　方法：1. UCBMSCs(來源于同濟(jì)大學(xué)干細(xì)胞庫)培養(yǎng)，并通過誘導(dǎo) UCBMSCs成骨、成脂以及成軟骨方向分化的作用，鑒定其多向分化潛能的干細(xì)胞特征；2.構(gòu)建Len

2、ti-Lacz-Luciferase和Lenti-miR-21-Luciferase慢病毒載體，并測定其MOI值，慢病毒轉(zhuǎn)染UCBMSCs后第4 d，D-熒光素鉀處理細(xì)胞，通過體外生物發(fā)光成像技術(shù)（Bioluminescence Imaging，BLI）檢測Luciferase表達(dá)情況，檢測轉(zhuǎn)染效率；3.在目的基因轉(zhuǎn)染 UCBMSCs后的0、1、4、7、14及28 d分別采用實時熒光定量PCR及Western Blot檢測目的基因及關(guān)鍵

3、成血管因子的表達(dá)；4.第3代 UCBMSCs分別轉(zhuǎn)染Lenti-Lacz-Luciferase和Lenti-miR-21-Luciferase后，接種于含有Matrigel的96孔板中，分別于接種后4h至48h在顯微鏡下觀察其tube結(jié)構(gòu)形成情況，并采用Olympus Cell R imaging軟件定量分析tube結(jié)構(gòu)長度；5.通過結(jié)扎裸鼠股動脈及腘動脈建立下肢重度缺血（Critical limb ischemia，CLI）模型，并將

4、UCBMSCs/miR-21、UCBMSCs/Lacz及生理鹽水各100μL分別注入臀大肌和腓腸肌，在1、4、7、14及28 d，利用熱成像技術(shù)示蹤移植細(xì)胞位置，激光多普勒彩超檢測其血管灌注量情況。28 d獲取標(biāo)本，在microfil下肢血管灌注后，取臀大肌和腓腸，4％多聚甲醛固定，脫水、石蠟包埋、切片做HE以及CD31免疫熒光染色，檢測新血管形成情況。
　　結(jié)果：1. UCMSCs在成骨誘導(dǎo)后第28天ARS染色中出現(xiàn)鈣結(jié)節(jié)，成軟

5、骨誘導(dǎo)后的第16天阿辛藍(lán)染色，成脂誘導(dǎo)后的第16天油紅O染色均出現(xiàn)陽性表達(dá)，說明 UCBMSCs具有多向分化能力的干細(xì)胞特性；2.慢病毒載體構(gòu)建成功，其轉(zhuǎn)染效率可達(dá)90%以上；3. qPCR結(jié)果表明，miR-21組的 HIF-1α和VEGF在第4天開始顯著高表達(dá)，并持續(xù)到7d和14d。其它關(guān)鍵成血管因子，SDF-1、bFGF、PLGF及 SCF也表現(xiàn)出與 HIF-1α和VEGF相同趨勢。Western Blot結(jié)果與qPCR結(jié)果相似；4

6、. Matrigel結(jié)果顯示在平行的三組實驗中，Lenti-miR-21-Luciferase組tube結(jié)構(gòu)最多，且長度最長；5. BLI檢測顯示植入 CLI區(qū)域的干細(xì)胞保持在植入?yún)^(qū)并未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，熒光在第3天表達(dá)最高，并持續(xù)到第28天。激光多普勒彩超顯示 CLI區(qū)域血管在術(shù)后第3天，實驗組的血管再生顯著優(yōu)于對照組，這種結(jié)果一直持續(xù)到術(shù)后28d。免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)實驗組CD31表達(dá)量高于Lacz組(3倍)及生理鹽水組(20倍)，這一結(jié)果